PCR原理及应用

2018.10.31 10:58
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聚合酶链式反应简称PCR,是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。PCR技术发展至今已相当成熟,被广泛应用于分子生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。

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  一、PCR基本原理

  PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物,它由变性——复性——延伸三个基本反应步骤构成。首先,根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列,合成两个不同的寡聚核苷酸引物,它们分别与DNA的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸(dDNA)、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的DNA分子混合,经过高温变性使DNA双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的DNA片段这三个阶段的一次循环,DNA的量即可增加一倍,而循环n次,则DNA的量增加2n倍,扩增反应(○1~○4)迅速地循环,产生了大量相同的片段,每一片段中均包含目的DNA片段。

  (1)模板DNA的变性:模板DNA经过加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,完成下一轮扩增反应;

  (2)模板DNA与引物的复性:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

  (3)引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列DNA序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,从5’端到3’端延伸出一条新的与模板链互补的半保留复制连,重复循环变性——复性——延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制连”,以这些新链为模板就可进行下一次的PCR循环。

  二、PCR技术的应用

  1、PCR在传染病的诊断和研究中的应用

  目前PCR在临床上应用广泛,其中前景最为广阔的是对传染病的诊断和研究。因为传染病的病原体无论是细菌,还是病毒或寄生虫,对于机体来说,就是一种外源入侵者,不论其致病是否由基因所致,只要病原体存在,机体内就会有其核酸存在,而且这种核酸顺序与人类基因组顺序往往不同,所以选择PCR技术进行诊断较细胞培养法、血清学方法更为简便、敏感和快速。

  在检测病毒方面,做得比较多的是对艾滋、人乳头状瘤病毒、人T细胞淋巴瘤病毒、EB病毒、肝炎病毒等的研究。以前AIDS病的诊断主要采用的是血清学的方法。虽然血清学试可以确定是否接触过HIV病毒,但它不能确定是否存在HIV感染。因为HIV感染者的外周血淋巴细胞中仅万分之一含有病毒RNA,所以采用体外培养来使HIV病毒繁殖,往往需要三到四周,而且不稳定。如果采用PCR技术来扩增HIV病毒的保守序列,再鉴定HIV病毒,则不仅使诊断的敏感度大大提高,而且时间也大大缩短。

  目前,国内用PCR检测病毒方面做得最多的是对肝炎病毒的检测,包括乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。采用PCR检测法可以测出每毫升血中仅0.4fg的乙肝病毒DNA,相当于130个病毒颗粒,其敏感度高于传统的检测法1000倍。可以清楚地看到,PCR以其特异、快速、敏感的特点必将成为临床微生物实验室的常规检测手段。

  2、PCR在遗传病的诊断和研究中的应用

  遗传病是一大类严重危害人类健康、影响人口质量的疾病。有些遗传病在胎儿出生后有一定的治疗手段,这一类遗传病如早期发现,便可早期治疗,防止其并发症特别是不可逆性的后果发生。而另一类遗传病目前尚无有效疗法,就应在患儿出生前做产前诊断,确诊后进行人工流产或引产,以保证人口质量,减少家庭和和社会负担。目前对遗传病的基因诊断方法主要是用DNA分子杂交和RFLP(restriction fragments length polymorphism,限制性酶切片段多态性)的方法,比较复杂、费时而且费用昂贵,PCR则为遗传病诊断提供了快速、简便而准确的手段。目前国内外采用PCR诊断的遗传病已有数十种,最常见的有α-地中海贫血、β-地中海贫血、镰刀状红细胞贫血、血友病(甲型、乙型)、苯丙酮尿症、肌营养不良症(DMD)亨延顿氏舞蹈症等。这些都是由于基因的突变缺失或重拍造成的遗传病。

  镰刀状红细胞贫血是由于正常人的β-珠蛋白链第6位上正常的谷氨酸突变成缬氨酸所致,用一对引物扩增含有突变部位的DNA片段(294bp),产物用限制性内切酶UxaNI(能特异性辨认GG TNAGG)消化后,琼脂糖凝胶电泳,用溴化乙锭染色观察。正常人(βsβs)有三个扩增片段191bp、103bp和294bp。

  DMD是男性中常见的一种性连锁致死性遗传病。DMD基因的双链DNA为14kb,序列已经清楚,大约50%~60%的病人存在基因的部分缺失。用双链DNA探针做Southern印迹可以检测基因的缺失,但必须用十余个探针,步骤多、时间长并且需要大量的完整的基因组DNA。Caskey等设计了多重PCR扩增系统,即加入多对位于一缺失的外显子中的引物,同时扩增。扩增后的产物可直接电泳观察,如有某个外显子缺失,就看不到相应的条带。这种方法快速、灵敏,可查出缺失型中的70%~80%。

  3、PCR在肿瘤的诊断、研究及残留癌细胞中的应用

  肿瘤的发生与演进是一个多阶段的过程,其中包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活,一起上述改变的遗传学基础主要是点突变、重排、扩增和缺失等。PCR技术为检测这些DNA异常提供了敏感、快速和特异方法,这不仅促进了肿瘤分子遗传学的发展,并为临床肿瘤学上的应用开创了新的条件。例如:(1)癌基因激活的检测;(2)抑癌基因失活的研究;(3)残留癌细胞监测中的作用;(4)在性别鉴定中的作用;(5) 在法医鉴定中的应用 ;(6)在器官移植配型中的应用等。

  4、基因克隆

  在PCR技术发明之前,有关核酸研究所涉及的许多制备及分析过程,都是即费力又费时的工作。例如,为了将一种突变基因通其已经做了详细研究鉴定的野生型基因进行比较,首先就必须构建突变体的基因组文库,然后利用有关探针进行杂交筛选等一系列繁琐的步骤,才有可能分离得到所需的克隆。只有在这种情况下,才能对突变基因作核苷酸序列的机构测定并与野生型进行比较分析。然而用PCR技术便能在体外快速的分离到突变基因。其主要步骤是根据预先测定的野生型基因的核苷酸序列资料,设计并合成出一对适用的寡核苷酸引物,用来从基因组DNA中直接扩增出大量的突变基因DNA产物,以供核苷酸序列测定使用。

  5、反向PCR与染色体步移

  常规PCR的一个局限性是,它需要设计一对界定在靶DNA区段两端的扩增引物,因此它只能扩增量引物之间的DNA区段。然而有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列。这就需要应用反向PCR技术,它能够有效地满足此种需要,而且对于染色体步移也有实际用途。

  6、基因的体外诱变与突变的检测

  基因的体外诱变是PCR技术的又一个重要的研究应用领域。它主要是利用寡核苷酸引物在碱基不完全互不配对的情况下亦能同模板DNA退火结合的能力,在设计引物时人为地造成碱基取代、缺失或插入,从而通过PCR反应将所需的突变引入靶DNA区段。然后将突变基因与野生型基因做功能比较分析,就可以确定所引入的突变的功能效应。这种PCR体外诱变技术也称重组PCR技术,在检测蛋白质与核酸的相互作用方面具有特殊的价值。


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