DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理：

　　琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

　　DNA的琼脂糖凝胶电泳实验材料：

　　DNA、试剂、试剂盒：琼脂糖、TBE电泳缓冲液、电泳载样缓冲液、溴化乙锭(EB)溶液母液、DNAGreen

　　仪器、耗材：水平式电泳装置、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、微波炉或电炉、紫外透射仪、照相支架、照相机及其附件

　　DNA的琼脂糖凝胶电泳实验步骤：

　　1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上;

　　2. 调整好梳子的高度;

　　3. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50篊时倒入制胶板中;

　　4. 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带;

　　5. 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;

　　pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样;

　　6. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动;

　　7. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5礸/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

　　DNA的琼脂糖凝胶电泳实验注意事项：

　　1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

　　(1)DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等，电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)

　　(2)胶浓度，U为迁移率，U0t 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率。

　　(3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

　　(4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5 V/cm

　　(5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃

　　(6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)

　　(7)电泳缓冲液 (0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE(均含EDTA pH8.0)。

　　2. 溴化乙锭(EB)为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

　　3. 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝(bromophenol blue, Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

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