DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤

2018.10.30 16:50
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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理:

  琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。

科研实验图.png

  DNA的琼脂糖凝胶电泳实验材料:

  DNA、试剂、试剂盒:琼脂糖、TBE电泳缓冲液、电泳载样缓冲液、溴化乙锭(EB)溶液母液、DNAGreen

  仪器、耗材:水平式电泳装置、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、微波炉或电炉、紫外透射仪、照相支架、照相机及其附件

  DNA的琼脂糖凝胶电泳实验步骤:

  1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;

  2. 调整好梳子的高度;

  3. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50篊时倒入制胶板中;

  4. 凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;

  5. 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;

  pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样;

  6. 将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;

  7. 电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5礸/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。

  DNA的琼脂糖凝胶电泳实验注意事项:

  1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:

  (1)DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)

  (2)胶浓度,U为迁移率,U0t 琼脂糖浓度:logU=logU0 Kr 为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率。

  (3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

  (4)所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5 V/cm

  (5)碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ℃

  (6)嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)

  (7)电泳缓冲液 (0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA pH8.0)。

  2. 溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。

  3. 电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenol blue, Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

  以上就是关于DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤的详细介绍,希望可以为大家提供帮助。本站会持续整理发布有关实验技术方面的内容,供大家参考学习,请继续关注!


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