Tounch down PCR原理和原则

2018.11.05 15:45
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一、Tounch down PCR原理

  Touchdown PCR,即降落PCR。是指每隔一个循环降低1°C或者是0.5°C反应退火温度,直至达到“Touchdown”退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增,并会将扩增的非特异性产物排挤出去。

  平时我们先用高温扩5~10个循环,再用低温扩增 15~25个循环,这样也是广义上的touchdown。原理就在于,温度的升高提高了PCR扩增的特异性,但也提高了引物结合的难度,降低了扩增的效率,因此一开始先用高温扩增,保证扩增的严谨性,待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低,无法和特异位点竞争)

科研实验图.png

  二、Tounch down PCR退火温度设计的原则

  1、降落 PCR 是在同一个 pcr 管内进行 PCR,只是每个循环的温度不同 (如每个循环降 1 度)。一般兼并引物用这种方法多些。

  2、设计多循环反应的程序, 以使相连循环的退火温度越来越低。 由于开始时的退火温度选择为高于估计的 Tm 值,随着循环的进行,退火温度逐渐降到 Tm 值,并最终低于这个水平, 用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间, 即那些产生目的扩增产物的反应物之间。 尽管退火温度最终会降到非特异杂交的 Tm 值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩下的循环中处于超过任何滞后 (非特异 )PCR 产物的地位。

  3、由于目标是在较早的循环中避免低 Tm 值配对,在 TD —PCR 中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越 15℃左右,从高于估计 Tm 值至少几度到低于它 10℃。

  4、例:一对没有简并的引物—模板的计算 Tm 值为 62℃。

  则:从 65℃— >50 ℃ (每 2cycles 降退火温度 1℃ ),再在 50℃退火温度下做 15 个循环。实验中如持续出现假象带 (杂带 ),则是因为起始退火温度太低,或目的扩增产物和非目的产物的 Tm 值相差无几,或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增,可把退火温度每降低 1℃所需的循环数增加到 3 或 4。

  5、 touchdown PCR 是为了增加反应的特异性,降低非特异产物的产生。在整个反应过程是一个温度由高到低的过程, 在温度降低的过程中, 会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度, 大量引物与模板结合,由此产生特异性产物;温度继续降低时, 未结合的引物已很少或没有,非特异性产物就很少或没有。

  设置温度时,高温以 Tm 较高的引物为准,低温以 Tm 较低的引物为准。

  我常用的程序是: 65C----50C, 1C/2s(2s 降低 1 度)


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