Tounch down PCR原理和原则

一、Tounch down PCR原理

　　Touchdown PCR，即降落PCR。是指每隔一个循环降低1°C或者是0.5°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。只有同同源性高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。

　　平时我们先用高温扩5~10个循环，再用低温扩增 15~25个循环，这样也是广义上的touchdown。原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)

　　二、Tounch down PCR退火温度设计的原则

　　1、降落 PCR 是在同一个 pcr 管内进行 PCR，只是每个循环的温度不同 (如每个循环降 1 度)。一般兼并引物用这种方法多些。

　　2、设计多循环反应的程序， 以使相连循环的退火温度越来越低。 由于开始时的退火温度选择为高于估计的 Tm 值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到 Tm 值，并终低于这个水平， 用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在互补的反应物之间， 即那些产生目的扩增产物的反应物之间。 尽管退火温度终会降到非特异杂交的 Tm 值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后 (非特异 )PCR 产物的地位。

　　3、由于目标是在较早的循环中避免低 Tm 值配对，在 TD —PCR 中好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越 15℃左右，从高于估计 Tm 值至少几度到低于它 10℃。

　　4、例：一对没有简并的引物—模板的计算 Tm 值为 62℃。

　　则：从 65℃— >50 ℃ (每 2cycles 降退火温度 1℃ )，再在 50℃退火温度下做 15 个循环。实验中如持续出现假象带 (杂带 )，则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的 Tm 值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低 1℃所需的循环数增加到 3 或 4。

　　5、 touchdown PCR 是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产生。在整个反应过程是一个温度由高到低的过程， 在温度降低的过程中， 会出现一个温度是上下游引物适的退火温度， 大量引物与模板结合，由此产生特异性产物;温度继续降低时， 未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。

　　设置温度时，高温以 Tm 较高的引物为准，低温以 Tm 较低的引物为准。

　　我常用的程序是： 65C----50C, 1C/2s(2s 降低 1 度)