RT-qPCR原理及应用

2018.11.05 11:00
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一、RT-qPCR原理

  RT-qPCR是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

RT-qPCR原理.png

  RT-qPCR包括三部分:

  ①依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA;

  ②用pcr扩增cDNA;

  ③实时监测和定量测定cDNA的量

  尽管已经选用为定量测定RNA的方法,这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点:①结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计;②逆转录反应不是标准化的,因此,可能多变性高;③数据分析高度主观化,如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此,通过质量评估每一个RT-qPCR组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求,与人类临床诊断分析有显而易见的关系。

  RT-PCR (qPCR)在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号,其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外,在单次反应中,用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中,单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值,这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高,Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时,这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管(均质)形式消除了扩增后手工操作的需要,显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。

  二、RT-qPCR的应用

  RT-qPCR这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生,利用①新鲜的、冷冻的或FFPE样品;②整体活组织检查、显微切割、单个细胞、组织培养细胞;③总RNA或mRNA;④一系列不同cDNA引发机制;⑤不同的酶或酶切反应体系;⑥不同效率、灵敏度和活跃的检测⑦多样的检测试剂、反应条件、热循环仪⑧个人的分析方式及报告方法。每一步都明显不具有标准化的检测,在样品处理、对照的使用、数据处理和质量控制处理的不同使这种不标准化进一步加剧,并且与RT-qPCR的可靠性、相关性和重复性有及其密切的关系。


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