关于RT-PCR实验的操作过程

2018.10.30 16:14
292 0 0

RT-PCR实验原理

  逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是基于从组织或细胞中提取总RNA的原理,以mRNA为模板,采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。以cDNA为模板扩增PCR,获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。

  RT-PCR实验优点

  RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏,对 RNA 的质量要求较低,操作简便,它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

实验操作.png

  RT-PCR实验的实验器具:

  1、 移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

  2、 吸头:1ml、200μl、20μl

  3、 匀浆管:5ml

  4、 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

  5、 EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

  6、 试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇

  7、 量筒:50ml、250ml、500ml

  8、 容量瓶:250ml、500ml、1000ml

  9、 试管架:5ml、1.5ml、20μl

  10、 盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

  11、 铝制饭盒:4个

  12、 塑料小饭盒:1个

  13、 大瓷缸:2个

  14、 锡泊纸:一卷

  15、 卷纸:2卷

  16、 三角烧瓶:带盖,稍大

  RT-PCR实验的具体操作过程如下:

  1、总 RNA 的提取

  按照总 RNA 提取实验步骤提取组织或细胞中的总 RNA。

  2、cDNA 第一链的合成

  目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

  (1)在 0.5 ml 微量离心管中,加入总 RNA 1~5 μg,补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 μl。在管中加 10 μM Oligo(dT)12~18 1 μl,轻轻混匀、离心;

  (2)70℃ 加热 10 min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min;

  (3)取 0.5 ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl。轻轻混匀,离心。42℃ 孵育 2~5 min;

  (4)加入 SuperⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min;

  (5)于 70℃ 加热 15 min 以终止反应;

  (6)将管插入冰中,加入 RNase H 1 μl,37 ℃ 孵育 20 min,降解残留的 RNA。-20 ℃ 保存备用。

  3、PCR

  (1)取 0.5 ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;

  (2)加入适量的 ddH2O,使总体积达 50 μl。轻轻混匀,离心;

  (3)设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28~32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在 PCR 扩增目的基因时,加入一对内参(如 G3PD)的特异性引物,同时扩增内参 DNA,作为对照;

  (4)电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;

  (5)密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

  RT-PCR实验注意事项:

  1、在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 的断裂;

  2、为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;

  3、内参的设定:主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。

  4、PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。

  5、防止 DNA 的污染: 采用 DNA 酶处理 RNA;在可能的情况下,将 PCR 引物置于基因的不同外显子,以消除基因和 mRNA 的共线性。

  以上就是关于RT-PCR实验操作过程的详细介绍,希望可以帮助到广大科研朋友。本站会持续整理关于实验技术类的内容供大家参考,敬请期待!


投诉文章 ©著作权归作者所有
喜欢  |  0
0/200字
没有更多评论了~
悬赏问题
给科研问题设置一定金额,将更容易获得关注与回答哦~
  • 1元
  • 3元
  • 5元
  • 8元
  • 18元
  • 自定义
选择支付方式
  • 微信支付
  • 支付宝支付
  • 余额支付

旗下网站

晟斯医学- 临床医生学术科研发展平台 2014-2019 晟斯医学版权所有
Copyright © 2014-2019 晟斯医学 All Rights Reserved. 备案号:苏ICP备11037034号-5 版权所有:南京孜文信息咨询有限公司