用TUNEL实验方法检测细胞凋亡

2018.10.22 16:09
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细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主和有序死亡,以维持体内平衡。细胞凋亡与细胞坏死不同。细胞凋亡不是一个被动的过程,而是一个活跃的过程。它涉及一系列基因的激活、表达和调控。它不是病理条件下的自身损伤现象,而是积极争取更好地适应生活环境的一种死亡过程。下面介绍一种检测细胞凋亡的实验方法——TUNEL法。

  TUNEL法检测细胞凋亡的实验方法原理:

  脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。

  毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

  实验材料:组织切片、冰冻切片、细胞

  试剂、试剂盒:磷酸缓冲液、蛋白酶K、氯化钴盐、蒸馏水、双氧水、二氨基联苯、丁醇、乙醇、二甲苯、甲醛、乙酸、松香水、抗地高辛抗体、氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、甲基绿、TdT酶反应液

  仪器、耗材:组织切片、冰冻切片、细胞

  试剂、试剂盒:磷酸缓冲液、蛋白酶K、氯化钴盐、蒸馏水、双氧水、二氨基联苯丁醇、乙醇、二甲苯、甲醛、乙酸、松香水、抗地高辛抗体、氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、甲基绿、TdT酶反应液

  仪器、耗材:光学显微镜、染色缸、载玻片、盖玻片

  实验步骤:

  一、试剂配制

  1. 磷酸缓冲液PBS(pH7.4):磷酸钠盐 50 mM,NaCl 200 mM。

  2. 蛋白酶K(200 μg/ml,pH7.4):蛋白酶K 0.02 g;PBS 100 ml。

  3. 含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4):H2O2 2.0 ml;PBS缓冲液 98.0 ml。

  4. TdT酶缓冲液(新鲜配):Trlzma碱 3.63 g用 0.1 N HCl调节pH至 7.2,加ddH2O定容到1 000 ml;再加入二甲砷酸钠 29.96 g和氯化钴0.238 g。

  5. TdT酶反应液:TdT酶32 μl;TdT酶缓冲液 76 μl,混匀,置于冰上备用。

  6. 洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠 17. 4 g;柠檬酸钠 8.82 g;ddH2O 1 000 ml。

  7. 0.05%二氨基联苯(DAB)溶液:DAB 5 mg;PBS 10 ml,pH7.4,临用前过滤后,加过氧化氢至0.02%。

  8. 0.5%甲基绿(pH4.0):甲基绿0.5 g;0.1 M乙酸钠100 ml。

  9. 100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。

  10. 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)。

  二、实验步骤

  1. 标本预处理

  (1)石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5 min。用无水乙醇洗两次,每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次,每次3

  min。用PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液(20 ug/ml),于室温水解15 min,去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次,每次2 min,然后按下述步骤2进行操作。

  (2)冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10 min后,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5 min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶液中,于-20℃处理5 min,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5 min,然后按下述步骤2进行操作。

  (3)培养的或从组织分离的细胞的预处理:将约 5 × 107个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定10 min。在载玻片上滴加 50-100 μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次,每次5 min,然后按下述步骤2进行操作。

  2. 色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5 min。用PBS洗两次,每次5 min。

  3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液,置室温1-5 min。

  4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应 1 h(注意:阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液)。

  5. 将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30 min,每10 min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动。

  6. 组织切片用PBS洗3次,每次 5 min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30 min。

  7. 用PBS洗4次,每次5 min。

  8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05% DAB溶液,室温显色3-6 min。

  9. 用蒸馏水洗4次,前3次每次1 min,最后1次5 min。

  10. 于室温用甲基绿进行复染10 min。用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30 s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。

  11. 用二甲苯脱水3次,每次2 min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果。

  三、注意事项

  1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确;

  2. 荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。


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