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染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验步骤详解

2018.10.18 18:03
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染色质免疫共沉淀技术的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白(转录因子)的靶基因有哪些。下面小编分享一些关于色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结的详细介绍,供大家参考!

  ChIP 实验原理

  在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

染色质免疫共沉淀ChIP实验原理.png

  可以利用 ChIP研究转录因子(transcription factor, TF)与启动子( promoter )的关联性。由于 ChIP 采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF 与 Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA 或 RNA )之间会产生共价键。细胞内, 当 TF 与 Promoter 相互结合 (生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近, 或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

  一般 ChIP 的流程是:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA 复合物相互结合——加入 Protein A ,结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物,并沉淀 ——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA 复合物——解交联,纯化富集的DNA-片断—— PCR 分析。

  ChIP 实验步骤具体如下:

  第一天:

  (一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

  1、取出 1 平皿细胞( 10cm 平皿),加入 243ul 37 %甲醛,使得甲醛的终浓度为 1%。(培养基共有 9ml )

  2、37 摄氏度孵育 10min。

  3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为 0.125M 。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置 5min 即可。

  4、吸尽培养基,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。

  5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中(PBS 依次为 5ml ,3ml 和 3ml )。预冷后 2000rpm 5min收集细胞。

  6、倒去上清。按照细胞量,加入 SDS Lysis Buffer 。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管 加 入 400ul SDS Lysis Buffer 。将 2 管混在一起,共 800ul 。

  7、超声破碎: VCX750 , 25%功率, 4.5S 冲击, 9S 间隙。共 14 次。当然,如果实验室有Bioruptor 这种神器的话那就轻松了。

  (二)、除杂及抗体哺育。

  8、超声破碎结束后, 10, 000g 4 度离心 10min 。去除不溶物质。留取 300ul 做实验,其余保存于-80 度。300ul 中, 100ul 加抗体做为实验组; 100ul 不加抗体做为对照组; 100ul 加 入 4ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M ), 65 度处理 3h 解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

  9、在 100ul 的超声破碎产物中,加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转混匀 1h。

  10、 1h 后,在 4 度静置 10min 沉淀, 700rpm 离心 1min 。

  11、取上清。各留取 20ul 做为 input 。一管中加入 1ul 抗体,另一管中则不加抗体。 4 度颠转过夜。

  (三)、检验超声破碎的效果。

  取 100ul 超声破碎后产物,加入 4ul 5M NaCl , 65 度处理 2h 解交联。分出一半用酚 /氯仿抽提。电泳检测超声效果。

  第二天:

  (一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

  12、孵育过夜后,每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转 2h。

  13、 4 度静置 10min 后, 700rpm 离心 1min 。除去上清。

  14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在 4 度颠转 10min ,4 度静置 10min 沉淀, 700rpm 离心 1min ,除去上清。

  洗涤溶液: a. low salt wash buffer----one wash

  b. high salt wash buffer-----one wash

  c. LiCl wash buffer------one wash

  d. TE buffer------two wash

  15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方: 100ul 10 % SDS, 100ul 1M NaHCO3 , 800ul ddH2O ,共 1ml 。每管加入 250ul 洗脱 buffer ,室温下颠转 15min ,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 500ul 。

  16、解交联:每管中加入 20ul 5M NaCl (NaCl 终 浓 度为 0.2M )。混匀,65 度解交联过夜。

  第三天:

  (一)、DNA 样品的回收

  17、解交联结束后,每管加入 1ul RNaseA ( MBI ), 37 度孵育 1h。

  18、每管加入 10ul 0.5M EDTA , 20ul 1M Tris.HCl ( PH 6.5), 2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2h。

  19、 DNA 片段的回收 ――― omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100ul ddH2O 。

  (二)、PCR 分析

  ChIP 技术总结

  (一)关于细胞

  细胞的生长状态要好。 因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络, 也很有

  可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 75%- 80%比较好。

  (二)关于抗体

  抗体是实验成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体,即使是 IP 级别的。

  单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。 两种抗体各有利弊。 单抗特异性强,背景低。 但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在 ChIP 甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭, 导致单抗不能识别靶蛋白。 多抗虽然没有这个问题, 但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。

  一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域) ,选择多抗比较稳妥一些。

  (三)关于交联与超声破碎

  这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

  交联不充分,只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合,富集得到的 Promoter 的量不高,实验假阴性。 交联过充分, 基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

  一般来讲,按照经验,交联条件取决于细胞类型。 不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如: NIH - 3T3 的交联条件是室温( 25 摄氏度)下 15min , 1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor 这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般,理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp- 1000bp。但是 200bp- 2000bp 的范围也是可以接受的。

  (四)关于操作

  希望尽可能的保持低温( 4 度)。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速( 500rpm 等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

  (五)关于解交联

  虽然说明书上说 4 小时已经足够, 但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA 不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。

  (六)关于 DNA 片段的回收

  需要注意的是:样品中 SDS 样品较高,普通的 PCR 产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入 SDS,影响 PCR 实验结果。小 Tip :过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除 SDS 沉淀。

  以上就是关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验步骤的详细介绍,现在染色质免疫共沉淀技术主要应用于组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”、转录调控分析、.药物开发研究、有丝分裂研究、DNA损失与凋亡分析等。如果想要了解更多实验技术内容可以到本站与科研大咖们一起探讨,共同进步!


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