探讨二甲双胍对T2DI\/I患者外周血白细胞NF-K B和11-1|3的抑制作用

　　探讨二甲双胍对T2DI\/I患者外周血白细胞NF-K B和11-1|3的抑制作用

　　许晓玲①

　　【摘要】目的：检验二甲双胍应用是否影响T2DM患者外周血白细胞NF-x B和IL-1 B的表达。方法：本研究募集汕头大学医学院第一附属医院内分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，根据使用二甲双胍与否分为对照组(未用二甲双胍)和二甲双胍组(口服二甲双胍，500～2 000 mg/d)。收集所有患者的外周血标本以检测外周血白细胞(PBLs)数量、生化参数和C肽。并从PBLs中分离取得总mRNA。半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)用于检测PBLs中NF-x B和IL-1 B的表达。结果：二甲双胍组空腹血糖、糖基化血红蛋白、低密度脂蛋白胆同醇均明显低于对照组，2小时C肽高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而两组总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆同醇和PBLs比较差异无统计学意义(P>0.05)。相比对照组，二甲双胍组FBC、HhAle和LDL-C水平较低，而2hC肽较高(P<0.05)。二甲双胍组NF-K B和11-1 B mRNA表达水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：结果显示二甲双胍不止改善廊糖、血脂及胰岛素p细胞分泌功能，还通过抑制NF-K B/IL-l B信号通路而在T2DM患者中发挥抗炎作用，这为二甲双胍在T2DM的抗炎益处提供了证据。

　　【关键词】2型糖尿病; NF-K B; 11-1 B; 二甲双胍

　　The Discussion about the Effect of Metformin on the Expression of NF- K B and IL-1 p in Peripheral Blood Leukocytes from Patients with Type 2 Diabetes

　　XU Xiaoling j

　　[ Abstract ] Objective: To test whether metformin application affec.ted peripheral hlood leukocyte NF- B and il-l in T2DM patients.Method: In this study,117 cases of T2DM patients in the department of endor,rinology of the First Affiliated Hospital of Shantou University were collected from Novemher 2015 to October2016.According to the use of metformin, they were divided into the control group (without Metformin) and Metformin group (oral Metformin, 500~2 000 mg/d).Peripheral hlood samples were collected from all the patients for testing PBL counts, biochemicalparametersand C peptide.Total RNA was isolated from PBLs.RT-PCR was used to examine the expression of NF- K B and 11-1 [3 in PBLs.Result: The fasting blood glucose, glycosylated hemoglohin and LDI. cholesterol inmetfnrmin group were significantly lower than those in the control group, 2 h C-peptirle level was higher than that in control group, the difference wa.q statj.qticallysignificant(P<0.05).The expression of NF- K B and IL-1 t3 mRNA in metformin group was significantly lower than that in control group, the difference wasstatistically signific.ant(P<0.05).Conclusion: The results showed that metformin not only improved hlood glucose, hlood lipid and insulin p cell secretion, hutalso played an anti-inflammatory role in T2DM patients hy inhihiting NF- K B/IL-l [3 signaling pathway, which provided evidence for the anti-inflammatory

　　[ Key words ] Type 2 diahetes; NF- K B; 11-1 [3 ; Metformin

　　研究显示T2DM是一种自身炎症性疾病‘“。NF-K B/IL-l B炎症信号通路在T2DM中发挥重要作用‘2】，可能成为T2DM抗感染治疗的潜在靶点，然而以炎症作为靶点的治疗还未应用于临床。有趣的是，现今用于降糖的药物，一些具有抗炎活性，这可能有助于改善临床结局。二甲双胍是临床治疗T2DM的一线、基础药物，不止改善高血糖症和胰岛素抵抗，也具有抗炎、抗肿瘤和抗老化作用，并改善其他的心血管风险因素，如超重状态或肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常、高血压、促凝状态和颈动脉内膜厚度”1。研究显示二甲双胍治疗IGT患者能减少单核细胞和淋巴细胞各种促炎因子的释放【4J。二甲双胍应用是否影响T2DM患者细胞NF-K B和11-1 p的表达，这需要进一步印证。因此，笔者将T2DM患者分为二甲双胍组及对照组，观察二甲双胍应用对T2DM患者外周血白血病NF-K B/IL-l p信号表达的作用，并阐述其潜在的抗炎作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 -般资料

　　本研究募集汕头大学医学院第一附属医院内分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，诊断符合1999年WHO糖尿病诊断标准，排除糖尿病急性并发症和其他严重的系统性疾病。根据使用二甲双胍与否，分为对照组(未用二甲双胍)及二甲双胍组(二甲双胍500～2 000 mg/d)。对照组54例，男28例，女26例，年龄22—71岁，平均(53.22±10.70。

　　1.2方法

　　1.2.1 PBLs分离 取新鲜外周抗凝血3—15 ml离心管中，400—500 g离心5 min，弃上清。加入6—10倍细胞体积的红细胞裂解液(KHC03 1.0 g，NH4C 18.3 g，EDTA-Na 0.037 g，加水至1 000 ml)，轻轻吹打混匀，裂解4～5 min。400～500 g离心5 min，弃红色上清。重复裂解一次。加入适量PBS(至少为细胞沉淀体积的5倍)洗涤1～2次，重悬沉淀，400—500 g离心2～3 min，弃上清。得到白细胞沉淀，用于提取总mRNA。

　　1.2.2 PBLs内总mRNA的提取 根据TaKaRa Total RNA提取试剂盒的要求和配置，提取白细胞总RNA，用于RT-PCR实验。

　　1.2.3 RT-PCR检钡4 PBLs中NF-K B和IL-i B mRNA表达水平 用所提取的白细胞总RNA合成cDNA -链(EasyScriptFirst-Stand r,DNA Synthesis SuperMix Kit Promega Biotech)， 进行PCR扩增(2*Taq PCR MasterMix kit TIANCEN Biotech)o PCR循环：94℃，3 mln;循环28次(94℃，30 s;59℃，30 s;72℃，l min);后72℃，10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照，Quantity-one软件分析计算条带灰度值，CAPDH作为内参。引物序列见表l。示，组间比较采用两组非独立样本￡检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　1.3观察指标

　　比较两组空腹血糖(FBCJ)、糖基化血红蛋白(HbAlc)、2hC肽(2 h C-P)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白一胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白一胆固醇(LDL-C)、外周血白细胞(PBLs)，以及两组NF-K B/GAPDH和11-1 p /CAPDH表达水平等。

　　1.4统计学处理

　　统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以(x+s)表岁);二甲双胍组63例，男27例，女36例，年龄42—80岁，平均(61.08±7.78岁)。两组患者一般性资料比较，差异无统计学意义fP>0.05)，具有可比陛。本临床研究已通过医院伦理委员会批准。

　　2结果

　　2.1 两组临床资料检查结果比较

　　二甲双胍组空腹血糖、糖基化血红蛋白、低密度脂蛋白一胆固醇均明显低于对照组，2 h C肽高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而两组总胆同醇、甘油三酯、高密度脂蛋白一胆固醇和PBLs比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

　　2.2 两组NF-K B/CAPDH和11-1 B /CAPDH表达水平比较二甲双胍组NFrK B和11-1 p mRNA表达水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图l。

　　表3两组NF-K B/GAPDH和11-1 B /GAPDH表达水平比较(i±s)

　　图1 NF-K B和IL-1 B的mRNA表达水平

　　注：A，两组PBLs中NF-K B，11-1 p和CAPDH的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果;B，两组NF-KB/CAPDH和11-1 B /CAPDH的相对mRNA表达水平的比较。

　　3讨论

　　研究证明，炎症在T2DM的发病机制中发挥着重要的作用l51。横断面和前瞻性的研究显示在肥胖和T2DM中具有高水平的急性时相标志物(包括C-反应蛋白、血清淀粉样-A和唾液酸)、白细胞、血浆凝固因子f纤维蛋白和纤溶酶原活化剂抑制剂一1)、促炎因子(TNF-仅、11-1 p和IL-6)和趋化因子。在胰腺胰岛，局部炎症能减少胰岛素释放和触发B -细胞凋亡，导致胰岛质量下降，而这在T2DM病情进展中发挥关键作用‘1。因此，炎症在T2DM的病理机制中发挥重要作用。

　　NF-x B在调节炎症中发挥重要作用。在静息状态，NF-K B通过结合于细胞中kappa轻链多肽基因增强子抑制剂a(IkBa)而定位于胞浆。当细胞受到炎症等刺激时，kappa轻链多肽基因增强子抑制剂激酶h(IKKh)激活，磷酸化IkBa蛋白并使其降解，NF-K B得以被释放并进入细胞核，通过结合特定的基因启动子和增强子kB序列而转录激活一系列的炎症基因l 81。研究显示T2DM患者肌肉细胞IK Ba含量降低，这提示增强的NF-K B信号。NF-K B激活后，可增强TNF-a和11-1 B等的基因转录，促使其产生和释放增加，后者又导致NF-K B的进一步激活，构成一个正反馈回路，造成不断恶化的促炎症反应环境。

　　IL-i p是研究的多的IL-1家族成员，因为其在介导自身炎症性疾病中的作用”01。研究发现，游离脂肪酸包括油酸、棕榈酸和硬脂酸等可以刺激胰岛Beta细胞产生11-l『川。而且IL-1可以刺激自身的表达，构成一个严重的恶性循环I他l。综上所述，NF-K B/IL-l炎症信号通路在T2DM中发挥重要作用，使其可能成为潜在的治疗靶点以对抗T2DM疾病炎症诱导的损伤。

　　二甲双胍是治疗2型糖尿病的基础、一线、全程药物，主要通过抑制肝脏糖异生而改善高血糖症，同时提高肝脏和外周组织的胰岛素敏感性””。前期研究显示，除了在糖代谢中的作用，二甲双胍也调节脂质代谢和发挥抗炎作用。血管内皮细胞实验显示二甲双胍通过活化AMPK而抑制NF-K B活性，从而减轻细胞因子诱导的促炎因子和粘附分子基因的表达。另外，在动脉粥样硬化斑块分离出的人类血管平滑肌细胞、巨噬细胞和上皮细胞中，二甲双胍通过抑制NFK B活性而抑制11-1 B诱导的IL-6和IL-8的释放”。在实验性动脉粥样硬化家兔的大动脉血管壁细胞中，二甲双胍抑制IK B磷酸化和NF-K B活化，提示其潜在的抗炎特性。

　　在本研究中，二甲双胍显著降低T2DM患者的FBG和LDL，提高2hC肽水平，并抑制PBLs中NF-K B和IL-i B的mRNA表达水平，这与前期细胞和动物实验中的研究结果是相符合的。研究提示二甲双胍不止改善血糖、血脂及胰岛素B细胞分泌功能，还通过抑制NF-K B/IL-l B信号通路而在T2DM患者中发挥抗炎作用，这为二甲双胍在T2DM的抗炎益处提供了证据。

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