微小RNA-320在缺氧诱导的大鼠神经细胞中的表达和功能研究

　　微小RNA-320在缺氧诱导的大鼠神经细胞中的表达和功能研究

　　罗旺胜，黄荣，宋郁喜，旃培艳

　　摘要：日的 研究微小RNA-320(microRNA-320，miR-320)在缺氧诱导的大鼠PC12细胞的表达特征，并探讨其对PC12细胞增殖和凋亡的影响。方珐 采用荧光定量PCR检测常氧组和缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达情况;转染miR-320 mimics(实验组)和mimics control(对照组)至缺氧诱导的PC12细胞，采用细胞增殖实验和ELISA法观察细胞增殖和凋亡情况。结果 缺氧诱导组PC12细胞中miR-3 20表达显著低于常氧组(0. 27±0.14vs l.01±0.21，P 0. 05)。对照组PC12细胞24、48和72 h增殖率分别为(11. 57±3.21)%、(14. 39±3.57)%和(17. 28±4.49)%，实验组分别为(19. 15±4.02)%、(24. 20±5.12)%和(29. 36±5.78)%。对照组PC12细胞中Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达量分别为(1. 67±0.52) Vg/L、(2. 15±0.24) Vg/L和(4. 66±0.79) Ug/L，实验组分别为(3. 01±0.77) Vg/L、(0. 33±0.04) pg/L和(1. 59±0.46) yg/L，2组比较有显著差异(P<0.05)。结论 miR-320在缺氧诱导大鼠PC12细胞呈现低表达，体外升高其表达具有促进缺氧诱导PC12细胞增殖并抑制凋亡的功能。

　　关键词：微RNAs;缺氧;PC12细胞;细胞增殖;细胞凋亡

　　Expression and function of miR-320 in hypoxia-induced rat nerve cells

　　Luo Wangsheng,Huang Rong,Song Yuxi,Zhan Pe

　　(Department o f Neurology,Wuhan Xinzhou District Central Hospital ,Wuhan Xinzhou District People's Hospital ,Wuhan 430400,llubei Province,China)

　　Abstract:Objective To study the effect of miR-320 expression on the proliferation and apoptosisof hypoxia-induced rat PC12 cells. Methods The PC12 cells were divided into normal oxygengroup,hypoxia group,experimental group and control group. The expression of miR-320 in PC12cells was detected by quantitative RT-PCR. The proliferation and apoptosis of PC12 cells trans-fected with miR-320 mimics or mimics control were detected by MTT assay and ELISA. Results　The expression level of miR-320 was significantly lower in hypo.xia group than in normal oxygengroup (0. 27+0. 14 vs l. 01+0. 21,P (6. 57+0. 92 'os l. 54+0. 21,P 3. 21%,14. 39% + 3. 57% ,17. 28%± 4. 49% respectively in control group and was 19. 15% +4. 02 % ,24. 20 %+5. 12 % ,29. 36 %+5. 78% respectively in experimental group at 24,48 and 72 hafter transfected with mimics control. The expression level of Bcl-2,Bax and caspase-3 was l. 67+0. 52 tl_g/L,2. 15+0. 24 Vg/L,4. 66+0. 79 tig/L respectively in control group and was 3..01+0. 77y_g/L,O. 33+ 0. 04 p_g/L,l. 59+0. 46 Ug/L respectively in experimental group. Conclusion Theexpression of miR-320 is down-regulated in hypoxia-induced rat PC12 cells. Elevated in vitro ex-　pression of miR-320 can promote the proliferation and inhibit the apoptosis of PC12 cells.

　　Key words: microRNAs ; anoxia ; PC12 cells ; cell proliferation ; apoptosis

　　缺血性脑卒中是一种受环境、遗传以及多因素、多基因相互作用的神经系统疾病1-2]。缺血性脑卒中的病因非常复杂，而不同的病因对脑卒中预后影响也不尽相同。研究发现，年龄、性别、遗传、高血压、糖尿病、心脏病、脂质代谢紊乱等是缺血性脑卒中发生的危险因素。大量研究表明，神经细胞对缺血缺氧非常敏感，如果在缺氧几分钟内，神经细胞不能充分代偿，会造成不可逆的细胞损伤[3-4]。微小RNA( microRNAs，miRNA)是一类存在于真核细胞中的内源性非编码单链小RNA分子，其主要通过与目的基因的非翻译区结合，抑制目的基因蛋白质翻译过程[5-6]。miRNA与细胞分化、增殖、凋亡及应激等过程关系密切，目前已成为生命科学研究的热点领域[7-8]。

　　近年研究表明，一些miRNA在脑卒中患者外周循环血中异常表达，可作为该疾病新的诊断分子标志物。例如，Qi等‘91对缺血性脑卒中与健康对照的研究发现，病例组循环miR-145表达水平显著高于对照组。Zhou和Zhangclo]对缺血性脑卒中患者研究发现，其外周血清miR-21和miR-24表达水平显著低于健康对照组，并可作为早期诊断标志物。Long等‘”1对缺血性脑卒中患者与健康对照的外周血miRNA行表达谱检测，发现miR-30a、miR-126及let-7b存在差异表达。本研究拟采用荧光定量PCR技术检测缺氧诱导的大鼠PC12细胞中miR-320表达情况，并通过细胞增殖实验和ELISA法观察其对细胞增殖和凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验设备和试剂 NanoDrop 2000c紫外分光光度计( ThermoScientific, USA), LightCycler480荧光定量PCR仪(Roche，Germany)，细胞培养箱及超菌工作台( BIO-RAD，USA)，荧光显微镜(蔡司，德国)。Trizol( Invitrogen，USA)、反转录试剂盒　TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Ambion，USA)，荧光定量PCR试剂盒SYBRpremix Ex TaqTMⅡPCR Kit( Takara, Japan),MTT试剂盒(Sigma，USA)，大鼠Bcl-2、Bax及caspase-3 ELISA试剂盒(Sigma，USA)公司，DMEM培养液及胎牛血清(Invitrogen，USA)，miR-320 mimics和mimics control(苏州吉玛，中国)，lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen，USA)。

　　1.2 细胞培养及转染 实验所用大鼠PC12细胞购自中科院上海细胞库。细胞复苏后，采用DMEM+10%胎牛血清在37'C、5% C02无氧或常氧细胞培养箱中进行培养48 h后，分别作为缺氧诱导组和常氧组。取对数期生长的细胞进行细胞铺板，当细胞融合度达75%左右，按照lipofectamine 3000转染试剂说明书，在缺氧诱导情况下，进行PC12细胞转染，实验组转染miR-320 mimics，对照组转染mlm-ics control。细胞转染6h后采用荧光显微镜观察转染效率。所有实验至少独立重复3次。

　　1.3 RNA提取按照Trizol试剂盒提取RNA，主要步骤如下：(1)在每1 ml Trizol试剂加入106个细胞标本中，冰上充分勾装，移液枪轻轻吹打细胞。(2)将混匀后的组织标本加入Eppendorf管中，剧烈震荡30 s，静置5 min。(3)加入氯仿0.2 ml，充分混匀后室温静置5 min。(4)在4℃，以12 000 r/min离心15 min，离心半径8 cm。(5)吸去上清后转入新的Eppendorf中，加入异丙醇0.5 ml，混勾后放置于4℃冰箱10 min。(6)再次在4℃，12 000 r/min条件下离心10 min，离心半径8 cm。去上清后留取沉淀，加入1 ml 75%已经预冷的乙醇，震荡洗涤沉淀RNA，7500 r/min离心5 min，离心半径8 cm。(7)吸去上清后空气干燥10 min，加入适量4℃DEPC水以充分溶解。

　　1.4 RT-PCR检测各组PC12细胞中miR-320表达参照反转录试剂盒TaqMan MicroRNA ReverseTranscription Kit说明书进行反转录试验合成cDNA。按照SYBR premix Ex TaqTMⅡPCR Kit试剂盒说明书，以合成的cDNA作为模板在Light-Cycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行定量反应。反应体系如下：模板cDNA 1肚1，上下游引物各0.5肚l，2×SYBR Green PCR Master Mix 10肛l，去离子水8弘l。PCR反应条件为：95℃10 min，随后95℃10 s，600C 30 s，72℃30 s，共45个循环。miR-320上游引物为5'-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGC-GA-3'，下游引物为5'-UCGCCCUCUCAACCCAG-CUUUU-3'; U6七游引物为5'-CUCGCUUCG-GCAGCACA-3'，下游引物为5'-ACGCUUCA-CGAAUUUGCGU-3'。各组细胞在不同培养箱培养48 h或缺氧诱导下细胞转染miR-320 mimics和mlmlcs control 48 h后，用2- AACT法计算荧光定量PCR仪所得数据。所有实验至少独立重复3次。

　　1.5细胞增殖实验 将培养好的对数期生长的缺氧诱导PC12细胞使用96孔板进行细胞铺板，每孔细胞数约为4500个，采用lipofectamine 3000按上述分组进行细胞转染，转染细胞每孔连续4d，每天加入20肛l 3一(4，5-=甲基噻唑一2)一2，5-=苯基四氮唑溴盐( MTT，5 g/L，Sigma-Aldrich)并室温孵育4h后去上清，之后每孔加入150弘l二甲亚砜(Sig-ma-Aldrich)孵育15 min予以充分溶解。测定各孔480 nm波长时的吸光度，并绘制生长曲线。实验组和对照组分别于转染24、48和72 h观察细胞增殖率。所有实验至少独立重复3次。

　　1.6 ELISA法检测细胞凋亡相关因子表达的水平将培养好的对数期生长的缺氧诱导的PC12细胞使用6孑L板进行细胞铺板，每孔细胞数约为105个，采用lipofectamine 3000按上述分组进行细胞转染，48h后收集各组细胞，并参照ELISA试剂盒要求测定各组细胞中Bcl-2、Bax及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达量变化。所有实验至少独立重复3次。

　　1.7统计学方法采用SPSS 19.O软件进行统计分析，数据均以x±s表示，采用Student's￡或单因素方差分析检验，P<0.05。

　　2 结 果

　　2.1 常氧组与缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达比较 常氧组PC12细胞中miR-320表达量为1. 01±0.21，缺氧诱导组PC12细胞中miR-320相对表达量为0. 27±0.14，缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达量显著低于常氧组(P<0.05)。

　　图1 miR-320在缺氧诱导组PC12细胞中的表达特征

　　2.2实验组与对照组PC12细胞中m1R-320表达比较 缺氧诱导PC12细胞转染miR-320 mimics和mimics control后，实验组和对照组细胞内源性miR-320表达分别为6.57±0.92和1.54±0.21，2组比较差异有显著性(P<0.05)。

　　图2实验组与对照组细胞内源性miR-320表达比较

　　2.3实验组与对照组不同时间细胞增殖率比较对照组PC12细胞24、48和72 h增殖率为分别为(11. 57±3.21)%、(14: 39±3.57)%和(17. 28±4.49)%，实验组PC12细胞24、48和72 h增殖率分别为(19. 15±4.02)%、(24. 20±5.12)%和(29. 36±5.78)%，实验组较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 实验组与对照组细胞中Bcl-2、Bax及caspase-3表达量比较 对照组PC12细胞中Bcl-2、Bax及caspase-3表达量分别为(1. 67±0.52) Fl_g/L、(2. 15±0. 24) V.g/L和(4. 66±0.79)tlg/L，实验组PC12细胞中Bcl-2、Bax及caspase-3表达量分别为(3. 01±0. 77)肛g/L、(0. 33±0.04) Vg/L和(1. 59±0.46)“g/L，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3讨论

　　先前已有研究表明，miRNA作为一类特殊的信号调节物质，主要通过对靶基因转录后抑制的特殊调控方式，广泛参与到多种生物的生命过程[12-13]。miR-320作为一种特殊的miRNA分子，在绝大多数肿瘤细胞及组织中呈现低表达，并发挥重要调控作用。例如，miR-320在乳腺癌呈现低表达，过表达miR-320抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭14]。低表达miR-320与胶质瘤恶性生物学行为密切相关，并抑制肿瘤细胞生长[15]。裸鼠移植瘤模型中，超表达miR-320可降低卵巢癌成瘤性‘16]。在本研究中，我们首先采用荧光定量PCR分析缺氧和常氧条件下PC12细胞中miR-320的表达情况，结果显示，缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达显著低于常氧组PC12细胞，上述实验结果与研究报道miR-320在肿瘤中出现的低表达状态一致‘15]。因此我们推测，低表达miR-320在缺氧诱导PC12细胞可能具有重要的生物学意义。

　　细胞增殖和凋亡是大脑细胞缺血缺氧损伤后的典型表现，也是发病机制中的重要环节口7。181。增殖和凋亡在脑缺血性损伤中有重要的作用。目前的研究表明，在缺血性脑卒中发生发展过程中，各阶段的神经细胞损伤均有增殖和凋亡的参与，而大脑神经细胞凋亡的程度也决定了神经受损的程度。本研究通过转染miR-320 mimics和mimics control至缺氧诱导的PC12细胞中，并采用MTT法观察其对细胞增殖的影响。结果发现，与对照组比较，实验组缺氧诱导PC12细胞转染miR-320 mimics可显著提高细胞内源性miR-320的表达水平。缺氧诱导PC12细胞过表达miR-320后，其24、48和72 h细胞增殖率显著升高，提示超表达miR-320可促进缺氧诱导PC12细胞增殖。

　　已有研究表明，miR-320不仅与细胞增殖行为相关，其亦可以调控细胞凋亡。研究显示，促凋亡因子Bax及抗凋亡因子Bcl-2在细胞中的表达失调，Bax/Bcl-2比值升高是细胞凋亡增加的重要标志之_[19]o caspases是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族，而caspases-3是该家族中的一个关键酶，caspases-3介导的蛋白剪切效应是决定细胞凋亡发生、发展的重要步骤，caspases-3表达增加及活性增高是细胞凋亡的重要标志[20]。本实验进一步采用ELISA观察其对缺氧诱导PC12细胞中Bcl-2 .Bax和caspases-3表达量变化，结果显示，实验组较对照组Bcl-2表达量明显升高;Bax和caspases-3表达量明显降低，说明表达miR-320可显著抑制缺氧诱导PC12细胞凋亡。由此我们推测，miR-320在缺氧诱导PC12细胞呈现低表达，并可能发挥重要作用。

　　综上所述，本研究结果发现，miR-320在缺氧诱导大鼠PC12细胞呈现低表达，过表达miR-320可以促进缺氧诱导PC12细胞增殖，并且抑制其凋亡，提示miR-320对缺氧状态下神经细胞具有保护作用。miR-320可作为治疗缺血性脑卒中疾病新的分子靶点。

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