药品微生物限度检查误差分析及应对措施

　　药品微生物限度检查误差分析及应对措施

　　宏伟 杨开金

　　【摘要】药品微生物限度检查是为保证药品安全以及药品质量而提出的标准化规范制度，只有大限度地减少药品微生物限度检查的误差，才能有效保证药品安全，提升药品质量。基于此，本文作者从可能引起药品微生物限度检查误差的培养基、无菌室、茵落计数、检品等方面入手，深入分析误差产生的原因，提出有效应对措施，为保证药品微生物限度检查的准确性提供一些参考。

　　【关键词】药品微生物限度检查误差分析应对措施

　　中图分类号：R927.1 文献标识码：B 文章编号：1672-8351( 2018 )10-0182-02

　　药品是特殊的商品，与人体健康安全息息相关，也是用来治疗和预防疾病的重要物质。影响药品质量的因素有很多，微生物是重要的影响因素之一，控制药品中的微生物也是确保药品质量的重要手段。但由于药品微生物限度检查环节要求严格、细菌培养时间长、不可控制因素多、操作步骤麻烦，所以出现误差的概率大。因此，分析药品微生物限度检查过程中产生的误差，并提出应对措施显得非常重要。

　　1药品微生物限度检查的概述

　　药品微生物限度检查是指微生物对药品的侵蚀和污染以及侵蚀和污染的程度，并对这种程度进行实验验证，通过一定的检测方法，确定药品中存在的微生物的含量以及是否存在某种致病菌的分析手段。这种实验的结果可以分析微生物对药品的影响，快速、准确地对药品进行微生物限度检查，并在此基础上采取有效的措施将微生物的污染作用遏制在一定范围内，对药品的生产和检验都具有重要意义，在一定程度上保障了药品的质量。

　　2影响药品微生物限度检查的因素分析

　　2.1样品的影响：样品独特性质是影响微生物限度检查的主要因素之一，也是微生物腐蚀污染重要因素。地理环境的污染，导致样品受到不同程度的污染，有些抵抗力弱的受到的污染严重，有，些抵抗力强的受到的污染较轻，如果以具有鲜活生命的微生物作为检测对象，得到的结果差别很大。

　　2.2检品中抑菌成分的影响：药品在进行微生物限度检查前，应对被检样品是否具有抑菌性或抑菌性大小进行研究分析，采取查资料和做实验的方法进行反复摸索。如果样品有抑菌性，采取适宜的方法除去抑菌成分，抑菌成分是否除去，用加菌回收试验判断。

　　2.3原料药的影响：在生产过程中，原料药是微生物污染的主要来源之一，生产或者检测药品时，虽然可采用一些灭菌措施杀灭污染微生物，但是有些无法消除的微生物会由此引入，如死菌体、毒素等，如果原料药中微生物含量太高，可能会造成灭菌失败，给药品安全生产和使用带来隐患。因此世界各国药典对原料药进行微生物限度检查都做了规定，消除或减少对药品产生的微生物污染。微生物控制是药品生产过程中用来确保药品质量和安全的至关重要内容。

　　3药品微生物限度检查的技术问题

　　3.1验证用菌株传代次数：细菌从培养到成熟到繁殖需要的时间相对来说是较短的，从一开始的细心培养到后来的繁殖后代被标记成不同的代数，将繁殖的菌株采取合理有效的保存方式，提高细菌的成活率。试验采用的菌株，传代次数在5代之内。想要保证试验菌株的生物学特性，获得的冻干菌种要采取合适的保藏技术，一般是-40℃低温冷冻。

　　3.2制作菌悬液的注意事项：需要注意的是制作菌悬液时，不同的微生物应该选用不同的培养基。因为微生物在适宜的培养基上生长繁殖较快，但是在不适宜培养基上可能不生长甚至可能出现死亡的现象。除此之外，每一种培养基对应的物种培养时间不同，有的是15～18h，有的是18～24h。在实验验证中，将研究对象进行处理均匀分布之后，要将其与液体混合分布，摇动试管、多次晃动，使其得到充分的结合，在此基础上添加稀释液，在稀释的过程中，只有努力保证实验过程的精确性，才能减少实验误差。稀释时也要注重比例的清晰，不可模糊对待，试管使用时要选择含刻度的，根据刻度精确测量，力求结果的准确完整。

　　3.3验证试验宜采用新鲜原菌液：无论是在试验中还是在非实验过程中选取使用的实验材料都宜采用新鲜的材料，这样能保证供试验用的菌液具有相当的活力，促进实验的顺利完成。菌液采用适合的方法保存后，浓度能在规定的数值内，同时，试验菌的活力会下降，也就造成对药品的耐受力的变化，所以在试验中，所有的菌液用新鲜制备，并且稀释好的原菌液。

　　3.4黑曲霉菌的影响：每一个物种的形成都需要一个过程，黑曲霉菌也不例外，对它的形成过程分阶段进行描述，其形成一般需要一个星期左右的时间，因此，孢子在培养基里驻扎比较牢固，要想将其洗脱完全，需要加入无菌氯化钠溶液，同时需要晃动盛有无菌氯化钠溶液的试管，用棉球轻轻擦拭，这样才能将呈黑褐色的孢子慢慢洗脱下来。还需要注意的是，漂浮着孢子的液体要用棉花进行过滤。

　　3.5验证用培养基的选择：培养基的质量很重要，它影响着微生物的生长、分离、鉴定及检验，实验结果的正确性与培养基有很大的关系。同时，在试验过程中，菌液组计数用的培养基要和微生物限度检查实验的培养基保持一致，这样才能使试验在各项条件都保持一致的情况下进行比对，如果存在太多变量整个实验的操作便没有任何意义。实验过程中，各个环节要严格按规定操作，不要发生任何意外。任何一个环节出现问题，就会导致整个实验失败。

　　4药品微生物限度检查误差应对措施

　　4.1培养基产生的误差分析及应对措施：培养基质量的好坏是药品微生物限度检查的重要环节，影响药品微生物限度检查结果。因此加强对培养基质量控制，显得尤为重要。目前微生物限度检查所用的培养基分为两种情况：市场购买的成品干燥培养基、自行按标准配制的培养基，无论哪种培养基都要确保灵敏性和有效性。对培养基进行已知菌检查：对制备好的培养基进行加菌培养，菌液浓度一般为50—100CFU/mL，菌液的制备要严格按照标准进行，培养结束后，观察菌落生长情况并进行计数，与按同法试验的标准培养基生长的菌落数进行比较，计算比值，通过比值的大小判断培养基的培养能力，比值一般要大于0.7。对培养基进行已知菌对照试验可直观检测培养基的灵敏度，就可以根据反应结果判断培养基是否适合药品微生物限度检查，很大限度地减少因培养基的培养能力带来的误差;对培养基进行pH值检查：一般细菌在培养基上适宜生长的pH值为7.2—7.6，培养基pH值的高低影响细菌的生长，一般情况下培养基灭菌消毒后pH值会降低0.2左右，配制培养基时，在灭菌消毒前把pH值调高0.2，使灭菌后的pH值符合规定要求，调节pH值一般用氢氧化钠溶液或盐酸溶液。在调节过程中，配制人员要耐心操作，少量多次，避免添加过量;培养基的灭菌：培养基配制后应及时灭菌，以免引起细菌繁殖生长，普通培养基采取湿热灭菌：121C,10—30min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。为了保证培养基的质量，一些研究人员采用低温灭菌的处理方式。尽管低温灭菌有一定效果，被广泛运用，但是有些菌种在低温情况下仍然能够存活，因此，应对灭菌后的培养基内细菌存活情况进行检查，采用高倍显微镜仔细观察培养基内的情况，以保证培养基符合药品微生物限度检查的要求。

　　4.2无菌室引起的误差及应对措施：药品微生物限度检查应在无菌室进行操作，能够减少一些不可控因素的影响，提高检验准确度，避免一些误差的产生。但无菌室的洁净情况、灭菌消毒状况必须符合药品微生物限度检查对环境的要求，因此必须加强对无菌室环境的控制，定期对无菌室进行清洁、消毒、检测，确保无菌室中沉降菌总数、尘埃粒子数等指标符合要求。无菌室空间一般利用紫外灯照射和臭氧发生器进行消毒，紫外灯产生的紫外线对空间的细菌起到一定的杀灭作用;臭氧发生器分解产生的单氧原子、氧化离子团，在无菌室空间循环流动，能够达到高效、无死角的灭菌效果。无菌室内操作台每次实验前后必须进行消毒处理。操作台面和其他可能被污染的死角一般用0.1%的溴化苄烷铵溶液擦拭或75qo乙醇擦拭，或交替进行，擦拭后再启动空气层流净化装置。定期对无菌室进行达标检测。检查的内容主要有沉降菌、浮游菌、尘埃粒子、空气流速、换气次数、温度、照度、相对湿度等等，具体检测方法参照相关标准，检测不符合要求的，要立即停止实验，应及时对无菌室进行处理，直到符合要求为止，以确保检验结果的准确性。

　　4.3菌落计数引起的误差分析及应对措施：菌落计数时，情况比较复杂：有的细菌生长小而密集、有的细菌生长大而重叠、有的生长在培养皿边缘、有的产生菌丝等等，计数难度较大，对菌落计数很容易产生误差。

　　菌落计数时认真观察，仔细辨认，可用肉眼正面观察也可平板背面点计，计数时要把需氧菌菌落、霉菌菌落、酵母菌菌落，同供试品的颗粒、油滴、气泡、沉淀物等分清楚，要确保琼脂内层和平皿边缘生长的菌落不出现漏计，必要情况下可使用低倍显微镜或者放大镜进行观察，对确实难以辨认的，也可采取涂片镜检，或者延长培养时间再进行观察。对于菌落生长多不可计的，应增加稀释级重新实验。为了把供试品稀释液中含有不溶解的辅料、原料及生成沉淀物等与菌落区分开来。在操作同时，可把适合稀释级的稀释液增加1—2个注皿，注皿凝固后放于冰箱冷藏室，与培养后的相同稀释级的平皿进行比对。也可在培养基中加入O.OOOl%TTC注皿，培养后根据不同颜色区分细菌菌落和其他物质。一定要在规定培养时间培养后进行菌落计数，一般来说，需氧菌培养时间为3—5d，霉菌、酵母菌培养时间为5～7。

　　4.4药品本身特性引起的误差分析及应对措施：药品特殊性或供试品制备过程中的操作不当也会对测定结果造成一定影响。药品所含成分具有抑菌作用，有的药品本身具有抑菌性，是已知的，比如抗生素制剂，但是也有一些中成药、化学制剂具有抑菌性，是未知的。为了判断药品是否有抑菌成分，应在微生物限度检查前进行方法学验证，以除去供试品的抑菌活性。一般情况下，可根据常规检验方法，按要求加入已知每ImL含50～100CFU的对照菌，同法试验，如果不能检出对照菌，或者检出的菌落数明显低于加入对照菌的数量，应采用培养基稀释法、中和法、薄膜过滤法等方法对供试品进行处理，确保能够检出对照菌;在供试品制备过程中，应严格按照无菌操作要求，防止接触任何可能引起污染的器物，尽量缩短检验时间。

　　5小结

　　药品微生物限度检查必须把无菌观念贯穿实验过程，实验的每个环节，每个步骤严格按照标准操作，实验结束后，要进行回顾性考察，确保实验每个环节无污染。同时检验人员要具备一定的专业理论水平和高度负责任的态度，技能娴熟、操作熟练，对检查结果能够正确判断，减少误差，确保微生物限度检查结果准确性。

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