大肠杆菌转化实验技术分享

2019.06.24 15:38
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  这次给大家带来的分享内容是有关于大肠杆菌转化实验的,接下来会分享热击法和高效率电转化法这两种,觉得有用的小伙伴可以收起来。

  第一种:热击法

  实验方法原理:质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42摄氏度短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。

  实验材料:质粒DNA、重组DNA

  试剂、试剂盒:LB培养基、蒸馏水、IPTG、X-gal、氨苄青霉素

  仪器、耗材:旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、离心管、双面微量离心管架、干式恒温气浴、恒温水浴锅、制冰机、恒温摇床、培养皿、超净工作台、酒精灯、玻璃涂棒、恒温培养箱

  实验步骤:

  实验材料准备

  1. 器材

  旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。

  2. 试剂

  培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。

  3. 材料处理

  无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。

  操作步骤

  1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

  2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 ul)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。

  3. 加入5 ul 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。

  4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。

  5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 ul LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

  6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 ul,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

  7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal,8 ul 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

  8. 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

  9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。

  10. 观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

  注意事项:

  1. 电击之前保持低温状态。

  2.电击杯使用完,用针头蒸馏水反复冲洗杯底,再用70%乙醇浸泡,4℃存放,使用前烘干即可,或者烘干后,-20℃冰箱存放。

  3.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。


  第二种:高效率电转化法

  实验材料:大肠杆菌

  试剂、试剂盒:LBSOC

  仪器、耗材:电转化仪、离心机、分光光度计

  实验步骤:

  1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

  2. 将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中,37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。

  3. 细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃,5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

  4. 加入500 ml 冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次,立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。

  5. 新鲜制得的细菌

  (1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中,2℃,5000g 离心10min。

  (2)估计细胞沉淀的体积,沉淀用等体积的冰冷水重悬。

  (3)按50~300ul 分装于预冷的微量离心管中。

  6. 冻存细菌

  (1)加入40 ml 冰冷的10%甘油,混合,然后按照步骤5离心。

  (2)估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。

  (3)按50~300ul 分装于预冷的微量离心管中。

  (4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

  7. 将电转化仪调到2.5 kV、 25 uF ,脉冲控制器调到200~400Ω;。

  8. 将1 ul 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。

  9. 将转化混合物转移到预冷的电转化池中,吸干池的外表面,然后放入样品槽中。

  10. 进行脉冲电转化,然后取出电转化池,马上加入1 ml SOC培养液,并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

  11. 于37℃,中速振荡培养30~60 min。

  12. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。

  这次的实验技术内容就分享到这里了,如果您需要咨询其他实验,可以上晟斯医学。

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