目的:建立和开发一种新型的从冻存脐带血中分离培养内皮祖细胞(EPC)的方法,探讨其生物学特性,提高冻存脐带血分离获得EPC的成功率.方法:自液氮罐中收集公共库中2000年至2001年保存的12例冻存脐带血,37℃水浴锅中快速复苏后,磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)洗涤,获得总有核细胞(TNCs),将TNCs接种至培养皿中诱导扩增EPC.使用流式细胞术和免疫荧光方法鉴定EPC并确定纯度.采用下列方法体外鉴定内皮祖细胞的功能:荧光显微镜观察细胞特异性摄取Dil-Ac-LDL和HTC-UEA-I的功能、在基质胶中形成毛细管样结构的情况,ELISA法检测释放VEGF因子的功能.结果:培养3周后,出现1-5个鹅卵石铺路石样内皮祖细胞集落.体外培养第1-3代EPC,其表面CD31、CD34、CD144和VEGFR(CD309)标记阳性率分别为(92.91±5.20)％、(30.0±23.27)％、(88.55±3.83)％和(67.21±12.12)％.EPC细胞具有特异性内吞Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-I、形成毛细管结构,释放低浓度VEGF因子等功能.结论:采用本方法从冻存脐带血中分离EPC的稳定性与重复性高,从冻存的脐带血中分离EPC的成功率可提高至85％.该方法为临床应用丰富的内皮祖细胞奠定了基础.