不同级别子宫颈上皮内瘤变患者血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a、miRNA-200a水平变化及其意义

　　不同级别子宫颈上皮内瘤变患者血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a、miRNA-200a水平变化及其意义

　　陈青 王泓泫 张丹丹 洪颖

　　【摘要】目的探讨血浆中小分子核糖核酸miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a在高危型HPV持续性感染及不同级别宫颈病变患者的变化与官颈病变的关系。方法收集3 1例高危型HPV持续性感染，19例CIN1，54例CIN2，71例CIN3，15例宫颈癌，42例正常对照组血浆及8例宫颈上皮内瘤变(CIN)1，29例CIN2，26例CIN3)宫颈组织，采用qRT-PCR方法检测miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a水平并分析结果。结果CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌组血浆中miRNA-21增高，miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a降低，CIN2、CIN3及官颈癌组血浆miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a水平分别与对照组、持续感染组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其他组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。CIN1、CIN2、CIN3组宫颈组织中miRNA表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。宫颈组织与血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a -致性检验Kappa值分别为0.7122、0.9998、0.89860.7458。结论不同级别宫颈上皮内瘤变患者血浆miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a与宫颈病变组织中的变化一致。

　　【关键词】小分子核糖核酸;高危型人乳头瘤病毒;官颈上皮内瘤变

　　官颈癌的发生主要与高危型人乳头瘤病毒( high-riskhuman papillomavirus，hr-HPV)感染有关。hr-HPV感染宫颈后，由于环境因素及与遗传基因相关的易感性等原因，使部分患者形成持续性感染，少数经过宫颈上皮内瘤变( CIN)终发展为宫颈癌。研究发现，在宫颈癌组织或细胞系中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a异常表达，其中miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a在发生官颈癌的进展中起到抑癌基因作用，而miRNA-21则起到癌基因作用”。目前几个小样本官颈癌患者血miRNA的研究提示血中相关miRNA可能成为宫颈癌的潜在生物标志物[4-5]。本研究采用前期研究筛查的血浆中miRNA的种类，探讨不同级别CIN中血浆miRNA与相应的宫颈组织的关系。

　　资料与方法

　　1.研究对象：选取2015年10月至2017年1月在南京大学附属鼓楼医院宫颈门诊并经病理证实宫颈病变患者和要求宫颈癌筛查的健康妇女共232例，其中hr-HPV持续性感染31例平均年龄( 42.39±8.23)岁，官颈上皮内瘤变( CIN) 159例的年龄(41.93±9.10岁)，其中CIN1 19例， doi:10.13 390/j.issn.1 672-1861.2018.04.018CIN2 54例，CIN3 71例，宫颈癌15例(49.73±8.42)岁。对照组选择健康体检及放置或取出宫内节育器妇女42例，平均年龄( 40.94±7.23)岁，TCT无异常和HPV阴性。排除其他恶性肿瘤、次全子宫切除和宫颈癌放化疗后患者，签署知情同意书。

　　2取材方法：抽取患者空腹静脉血5 ml后迅速离心，2 000 r/min，10 min，上清液- 80℃冰箱保存。选择有血标本的63例患者(8例CIN1，29例CIN2，26例CIN3)宫颈组织标本提取miRNA(本院病理科诊断，符合的病理组织取三明治法组织切片的中间一片)。

　　3.miRNA提取：将-80℃冰冻保存的血浆和石蜡包埋宫颈组织进行miRNAs的提取，操作方法依据miRCURYTMRNA分离试剂盒(EXIQON，大连宝生物公司)说明书，提取的miRNAs保存于-80℃冰箱中备用。

　　4.逆转录及qRT-PCR检测：使用逆转录试剂(TaKaRa)(辽宁大连宝生物公司)将2 yl从血浆中提取的miRNAs逆转录成具有茎环RT引物的cDNA的10，斗l体系。通过TaqManmiRNA Assays试剂(Life Technologies, USA) 将cDNA配成20 Vl体系后，在7300qRT-PCR system( ABI，Foster，CA)下首先扩增外参miRNA-2911，若所得的CT值之间相差≤l才可对目的基因及内源对照进行扩增，否则剔除重新提取，随后扩增miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200 a和内源对照miRNA-let7d，miRNA-7i和miRNA-7 g混合物(定量PCR基因引物序列如下：miRNA-21:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA.3’。miRNA-214:5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。miRNA-34a:5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3.miRNA-200a:5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3).PCR循环：95℃5 min，随后40次循环95℃15 s，60℃1 min。宫颈组织中提取miRNAs与上述步骤一致，内源性对照为U6且不需要检测外参miRNA-2911。每个样本重复3次检测。实验过程均在冰上操作。

　　5.统计学分析：GraphPadInStat 5.0版软件用于分析所得的2。△CT值，以均数±标准差表示，血浆和组织的每种miRNA在各分组间比较，采用非配对样本f检验，P< 0.05时认为差异有统计学意义。每种miRNA血浆检测结果与宫颈组织中检测结果进行Kappa检验，Kappa≥0.75两者一致性较好;0.75> Kappa≥0.4两者一致性一般;Kappa< 0.4两者一致性较差，认为没有一致性。

　　结 果

　　1.不同级别官颈病变中miRNA-21的变化：CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌组血浆中miRNA-21的表达增高，其中CIN2、CIN3及宫颈癌组血miRNA-21水平与对照组和持续感染组比较，差异有统计学意义( P<o.ol);cin1组和cin2、cin3及宫颈癌组比较，变化一致，差异无统计学意义(p0.05)。CrNl、CIN2、CIN3官颈组织中miRNA-21比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。血浆与宫颈组织的结果变化发一致性检验Kappa值为0.712。

　　表1 不同级别宫颈病变血浆中miRNA在水平比较(xts)

　　2.不同级别宫颈病变中miRNA-214、miRNA-200a，miRNA-34a的变化比较：CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌血浆中miRNA-214，miRNA-200a，miRNA-34a均有下降，其中对照组与CIN2、CIN3及宫颈癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。持续感染组与CIN2、CIN3及官颈癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其他组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。持续感染组与CIN2和CIN3及宫颈癌组血浆miRNA-214比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。CIN1、CIN2、CIN3宫颈组织中miRNA-214、miRNA-200a、miRNA-34a表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。CIN患者血浆与宫颈组织miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a -致性检验Kappa值分别为0.7122、0.9998、0.8986和0.7458。

　　3. 讨 论

　　1. miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a变化与宫颈癌相关：miRNA-21在宫颈癌细胞系促进细胞增殖，抑制凋亡嘲。miRNA-34a在多种肿瘤的发生发展中发挥了重要的抑癌基因作用，调节细胞增殖、分化和凋亡等[7]。miR_214[8]、miRNA-200与miRNA-214类似，表达水平降低。其miRNA-200通过影响上皮.基质转化和破坏细胞因子受体之间的作用参与肿瘤转移嘲。Li等发现miRNA-34a在宫颈病变及宫颈癌中表达下调，且与正常宫颈组织比较，均具有统计学差异。本文主要针对232例官颈病变患者及健康女性的血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a和63例宫颈组织中的检测，发现miRNA-21随着病变级别升高呈上升趋势，其余三种miRNAs呈下降的趋势，与相关文献4.8-10]报道一致。

　　2.不同宫颈病变血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a的变化：有几个小样本宫颈癌患者血miRNA筛查的研究，提示血中相关miRNA可能成为宫颈癌的潜在生物标志物。徐修云等筛选的血浆中miRNa种类，可以认为是本研究的基础，为了证明血浆中miRNA反映宫颈组织中相应miRNA表达的变化，本研究发现血浆中miRNA-21增高，miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a减少的改变与宫颈病变标本中的改变一致。可以通过对正常女性或高危型HPV持续感染患者联合检测血浆中这四种miRNAs血液浓度，辅助诊断是否患宫颈病变有参考价值。将来也许可以通过检测血浆中miRNA-21增高，miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a降低，判断是否存在宫颈病变可能。

　　总之，高危型HPV持续性感染引起的宫颈癌前病变及官颈癌仍是严重威胁我国女性健康的疾病之一。血浆中miRNA-21、miRNA-214、miRNA-34a和miRNA-200a在不同级别宫颈病变变化与宫颈病变组织中的变化一致。进一步对miRNAs在相关疾病中作用机制的研究，将对诊断、预测及治疗癌前病变及宫颈癌提供新的思路。

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