TGF-B 1和Smad4在中重度官腔粘连组织中的表达及临床意义

　　TGF-B 1和Smad4在中重度官腔粘连组织中的表达及临床意义

　　李灿宇 党秋红 刘欢欢 张钦山 申爱荣 

　　【摘要】目的探讨官腔粘连患者子宫内膜组织中转化生长因子B 1( TGF-p 1)、果蝇同源序列蛋白4( smad4)表达及其相关性。方法选取官腔粘连患者60例，包括中度和重度粘连各30例，正常内膜组织作为正常对照20例。免疫组化检测内膜组织中TGF-B 1、Smad4的表达情况，分析其与粘连程度的关系及两者表达的相关性。结果与正常对照组比较，TGF-B 1在粘连组织中的表达水平显著升高(P=0.006)，在重度粘连组织中的表达更为明显(P=0.004);与对照组比较，Smad4在中度粘连组中的表达差异无统计学意义，而在重度粘连组中表达显著增加( P-0.023);Smad4在中度粘连和重度粘连组织中的表达比较差异有统计学意义(弘0.039);在粘连组织中，TGF-B 1和Smad4表达未见显著相关(P=0.156)，但在重度粘连组织中呈显著正相关(P=0.039)。结论TGF-B 1、Smad4表达均与粘连程度有关，两者可能共同促进了官腔粘连的晚期发展，联合检测有助于辅助诊断。

　　【关键词】官腔粘连;转化生长因子-B 1;果蝇同源序列蛋白4;免疫组化

　　官腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)又称Asherman综合征，临床表现为闭经、经量减少、继发不孕、反复流产及腹痛等。轻度官腔粘连不影响生育，一般不需要治疗，而中、重度官腔粘连多需要手术治疗，且术后疗效差异较大，重度官腔粘连的复发率高达62.5%[1]。研究官腔粘连发生发展的分子机制，为患者个体化治疗提供重要参考。官腔粘连与细胞因子的表达异常有关，但机制还不明确[2]。本研究采用免疫组化方法检测TGF-B 1、Smad4蛋白在中重度官腔粘连组织中的表达，并探讨两者与粘连程度的关系。

　　资料与方法

　　1.临床资料：选取在2013年1月至2015年12月在郑州大学第三附属医院行官腔镜检查、确诊官腔粘连并行官腔镜下手术治疗的患者60例，根据官腔镜官腔粘连评分系统评分”，选取中、重度粘连各30例。患者平均年龄30岁(21～42岁);主要症状：月经量减少50例(830/0)，闭经4例( 7070)，腹痛3例(5%)，因不孕症体检发现者3例( 50/0)。有流产、引产病史者57例(950/0)，有官腔镜下官腔粘连分离病史的患者5例( 8.30'/0)。选取同期经官腔镜检查确诊为子宫纵膈患者20例为对照组。患者平均年龄29岁(20～41岁);主要症状：不良孕产史12例(600/0)，不孕5例( 25010)，体检发现3例(150/0)。排除标准：①术前口服激素类药物或其他可能影响雌激素药物代谢的;②官腔镜检查证实有其他子宫内膜疾病(例如子宫肌瘤、子宫内膜息肉、子宫腺肌病等);③性激素六项异常者;④乳腺疾病者。研究组采集官腔内粘连组织，对照组采集官腔内非纵膈处正常子宫内膜组织，标本采用10%福尔马林固定。本研究经本院伦理委员会审查批准。

　　2.实验方法：所有组织标本经石蜡包埋，4ym连续切片，用苏木素，伊红( HE)染色观察细胞学变化，用Envision免疫组化二步法检测TGF-B 1和Smad4蛋白表达情况。TGF-B 1(ZS-146)和Smad4(ZS-7966)鼠抗人单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。严格按照试剂盒说明书进行操作，阳性对照切片由试剂公司提供，染色结果阳性。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗，染色结果阴性。

　　3.结果判断：阳性结果判定：每张切片选10个高倍视野(400倍)，根据染色程度及染色范围来计算评分。染色程度：0分为阴性，1分为弱阳性(低倍镜下可疑阳性、高倍镜下明确为阳性)，2分为中等阳性(低倍镜下明确为阳性)，3分为强阳性(低倍镜下强阳性);染色范围：0分指无阳性染区，1分为1%～25%，2分为26%～50%，3分为51%N75%，4分为>75010。上述两项评分相加除以2作为每例的总评分。

　　4.统计学处理：采用SPSS 19.0统计软件包对所得数据进行处理。计量资料以xis表示，组间比较采用单因素方差分析，两独立样本的均数比较用f检验，相关分析采用Pearson相关性检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　结 果

　　1.TGF-B 1和Smad4蛋白在官腔粘连组织中的表达：TGF-B 1蛋白主要在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的细胞质中表达，Smad4也在子宫内膜上皮细胞和间质细胞的胞质中表达，均呈淡黄色、棕黄色或棕褐色表达，见图1。两者在各组中的表达情况见表1。

　　图1 TGF-B 1、Smad4在正常对照和官腔粘连组织中的阳性表达Envision二步法 ×100

　　a：TGF-B 1在正常对照组中的表达;b：Smad4在正常对照组中的表达;c：TGF-B l在中度官腔粘连组织中的表达;d：Smad4在中度官腔粘连组织中的表达;e：TGF-B 1在重度官腔粘连组织中的表达;f：Smad4在重度官腔粘连组织中的表达。

　　表1 TGF-8 1、Smad4在正常对照子宫内膜和官腔粘连组织中的表达(孑±s)

　　2.TGF-B 1表达与官腔粘连程度：与正常对照组比较，TGF-B 1在粘连组织中的表达水平显著性升高(P=0.006)，在重度粘连组织中表达水平差异更具显著性( P=0.004)。TGF-B 1在中度粘连和重度粘连组织中的表达未见显著性差异( P=0.264)。

　　3.Smad4表达与官腔粘连程度：正常对照组比较，Smad4在中度粘连组织中表达升高，两者比较，差异无统计学意义，而在重度粘连组中表达显著增加( P=0.023)。Smad4在重度粘连组织中的表达显著高于中度粘连组织( P=0.039)。

　　4.TGF-B 1和Smad4表达的相关性：Pearson相关性分析结果显示，TGF-B 1和Smad4在中度粘连组织中表达未见显著相关( P=0.156)，两者在重度粘连组织中呈显著正相关(仁0.039)。

　　讨 论

　　官腔粘连是一种严重影响育龄期妇女妊娠的疾病，其致病因素包括流产、清官、手术及感染等，子宫内膜基底层受损，缺血缺氧状态使内膜失去营养支持，上皮细胞及间质细胞生成障碍，新生血管形成受阻，导致子宫内膜无法再生修复，正常子宫内膜被僵硬的、致密的、纤维化、瘢痕化的结缔组织取代，终形成粘连。尽管研究官腔粘连的发生可能与细胞因子、雌激素、微RNA等作用有关，但其发病机制目前还不清楚。

　　转化生长因子B是目前研究已知的强的促纤维化因子，其介导的信号传导作用促进成纤维细胞增殖和合成细胞基质，促使组织纤维化发生，而TGF-8 1在细胞信号传导中起主要作用。研究表明TGF-B 1在器官纤维化发生中发挥了重要作用。也有研究表明TGF-B 1在官腔粘连组织中表达高于正常子宫内膜组织，且与粘连程度有关[6]。本研究结果也表明，TGF-8 1在子宫粘连组织中的表达显著高于正常内膜组织，尤其在重度粘连组织中更明显。但在中度和重度粘连之间并未见显著性差异，这与其他研究结果不相一致，TGF-B 1在促进宫腔粘连发展过程中的作用机制可能还需要进一步探讨。

　　Smad信号传导通路在组织纤维化发生过程中发挥着重要作用，而Smad4是信号传导通路中关键中介因子。研究表明Smad4参与了组织纤维化的发生[8]，而在官腔粘连组织中的表达鲜有报道。本研究结果表明，Smad4表达虽然在中度和重度粘连组织中表达逐渐升高，与正常子宫内膜组织相比，仅在重度粘连官腔组织中的表达存在显著差异。这提示Smad4可能是官腔粘连形成晚期的一种分子表现，可能促进了粘连程度的进一步加重。

　　Smad4与组织纤维化发生关系密切，抑制Smad4表达可阻止纤维化的发生，其机制可能与抑制TGF-B诱导的I型胶原表达有关。本研究结果显示，TGF-B 1在中度粘连时表达即发生显著升高，而Smad4则在重度粘连时才发生显著升高，在重度子宫粘连组织中TGF-B 1和Smad4表达呈显著正相关，提示Smad4表达增加可能是TGF-B l诱导的粘连发生时的晚期分子表现。抑制Smad4的表达能否阻止或逆转TGF-B 1诱导的粘连发生，值得进一步深入研究。总之，TGF-B 1、Smad4表达均随官腔粘连程度加重而升高，可能共同促进了官腔粘连向晚期阶段发展，联合检测二者表达有助于辅助判断粘连程度，抑制其信号通路可能有助于探索延缓粘连加重的新治疗手段。

　　参考文献

　　[1]中华医学会妇产科分会.官腔粘连临床诊疗专家共识.中华妇产科杂志，2015，50(12):881-887.

　　[2]戚亚琴，王素敏.官腔粘连发病机制的研究进展[J].医学综述，2016, 22(5):932-935.

　　[3]陈灿明，王奕芳，顾小燕，等.官腔粘连病因学及治疗研究进展[J].国际妇产科学杂志，2016，43(3):250-253.

　　[4]蔡慧华，何援利.官腔粘连发病机制的研究进展[J].重庆医科大学学报，2017，42(4):455-459.

　　[5]Lang Q,Liu Q,Xu N, et al.The antifibrotic effects of TGF-B 1siRNA on hepatic fibrosis in rats[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 409(3):448-453.

　　[6]Salma U,Xue M, Ali Sheikh MS, et al.Role of transforming growth factor-B 1 and smads signaling pathway in intrauterine adhesion[J]. Mediators Inflamm, 2016, 2016(6):4158287.

　　[7]周曼萍，何援利，乔琳，等.转化生长因子-B1及Smad2/3在官腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义[J].广东医学，2014,35(12):1844-1847.

　　[8]Morishita Y Yoshizawa H,Watanabe M, et al.siRNAs targetedto Smad4 prevent renal fibrosis in vivo[J]. Sci Rep, 2014,4(9):6424.

　　[9]郭宝良，闫朝岐，仲雷，等.Smad4 siRNA对转化生长因子p诱导I型胶原表达的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(11):2062-2065.