VEGF、TNF-仪、miR-93/106b和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达

　　VEGF、TNF-仪、miR-93/106b和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达

　　张冬红1，刘恩令1，田卫2，张志勇3，王立群1 1.唐山市工人医院妇科，河北唐山063000;2.唐…市丁人医院检验科，河北唐山063000;3.唐山市工人医院病理科，河北唐山063000

　　摘要：目的分析VECF. TNF-a、miR-93/106b和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达情况，为『.霄肌瘤的预防和治疗提供理论依据。方法选取2015年3月- 2017年3月在唐山市工人医院接受手术治疗的子宫肌瘤患者的mlJf~ij组织标本100份为病例组，另选取肌瘤旁正常的子宫肌层标本100份作为对照组。分离和培养平滑肌瘤和子宫肌层的平滑肌细胞，jlJrI1，i。.，l试剂按照说明书提取试剂盒制备总RNA，采用miRNA芯片检测VEGF、TNF-“、miR-93/1061)和MCM7的表达。结果miRNA芯片检测结果和PT-PCR检测结果均显示，病例组VEGF、TNF-a. miR-93/106b和MCM7的表达量均明显r于对照组，差蚪彳『统汁学意义<o.05)。接受激素治疗者子宫平滑肌瘤组织中mcm7表达水平升高，mir p="" 1061)和mcm7在子宫肌瘤组织中均为高表达，激素治疗对mcm7及mir-97表达结果影响不显著，对vegf、tnf—d结果有明显影响。<="" mir-93="" tnf-a.="" -97表达水平降低，v}cgf.?l?ny_a表达水平升高，与未接受治疗者比较，差异有统计学意义(jp

　　关键词：子宫肌瘤;VEGF; TNF-ct; miR-93/106b;MCM7

　　中国图书分类号：R711. 74文献标识码：B文章编号：10014411( 2018) 11_2569_04;doi：10 7620/zgryhj.j.i。。n.l001-4411. 2018.…56

　　子宫肌瘤多发于生育年龄，绝经后大部分萎缩或消退。有研究[2]显示，ER、PR、Ki-67对疾病的发生起到一定作用。实验研究表明，雌激素代谢酶CYPIA1及COMT基因多态性、SVEGF、TNF -a与子宫肌瘤具有相关性。微小RNA (miRNA)是一类非编码单链小分子RNA，参与调控细胞增殖、分化、凋亡及迁移等多种生理过程。新研究发现，miRNA在子宫肌瘤细胞转化、组织重构、血管生成及炎症反应等方面均起着重要调控作用。但是关于VEGF、TNF-a、MCM7及miR-97在子宫肌瘤组织中表达的研究较少，因此本研究分析子宫肌瘤组织中VEGF、TNF-a、MCM7及miR - 97的表达情况，探讨其形成、发展机制，从而对进一步治疗该疾病及预防子宫肌瘤的发生具有非常重要的指导意义。

　　1资料与方法

　　1.1 资料

　　1.1.1 一般资料选取2015年3月-2017年3月在唐山市工人医院接受手术治疗的子宫肌瘤患者的肌瘤组织标体100份作为病例组，纳入标准：①均经过影像学及病理检查确诊为子宫肌瘤611，;②年龄20~49岁;③经过医院医学伦理委员会通过后患者知情并同意本次研究。排除标准：①合并其他严重器官疾病;②不合作的患者。年龄20~46岁，平均(39.9±10.6)岁。另选取肌瘤旁正常的子宫肌层标本100份作为对照组，年龄21~ 47岁，平均(40.5+11.6)岁。两组研究对象年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。对子宫肌瘤患者是否在手术前3个月接受激素治疗分为未治疗组和治疗组，每组各50例。本研究获得医院伦理委员会批准。

　　1.1.2 试剂及材料 

       DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国);胰蛋白酶(碧云天，中国);PBS(北京中杉);青霉素一链霉素溶液( 100X) (碧云天，中国);DMSO(Amresco，美国);EDTA(Sig-ma，美国);一抗：VEGF(兔来源);一抗TNF-a(兔来源);一抗：miR - 93/106b(兔来源);一抗：MCM7(Abcam，英国);内参一抗F- actin(兔来源)(Abcan.，英国);二抗：羊抗兔IgG(sigma，美国);PVDF膜(Bio - Rad，美国);ECL增强化学发光检测试剂盒(PIERCE，美国);甲基磺酰氟( PMSF) (Sigma，美国);TEMED(Amersham Phar-macia Biotech，美国);Easye—see预染蛋白质Marker(Bio -Rad，美国);牛血清白蛋白(Amersham Phar-macia Biotech，美国);蛋白裂解液(碧云天，中国);引物( Western Biotechnology);DEPC(Sigma，美国);TRIzc，l(碧云天，中国);反转录试剂盒(code: 6120A) (Takara，日本);Premix Ex taq(Takara，日本);Dured核酸染料(北京泛博生化)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本的采集 手术标本离体后，于5 ruin内切取肌瘤组织100份和正常的子宫肌层100份，迅速放入液氮中保存，并于-80℃的冰箱中长期保存。

　　1.2.2分离和培养平滑肌瘤和子宫肌层的平滑肌细胞从未治疗组取少量平滑肌瘤和配对的子宫肌层，用来分离平滑肌瘤细胞和子宫肌层平滑肌细胞作预试验。LSMC和MSMC在细胞培养基中用10%的小牛血清培养。

　　1.2.3 细胞总RNA的提取 用Trizol试剂按照说明书提取试剂盒制备总RNA，取核酸RNA样品，用核酸分析仪进行定量，测定260 nm和280 nm的吸光度值，用凝胶电泳确定RNA量，用于cDNA反转录合成。

　　1.2.4miRNA芯片检测VEGF、TNF一仪、miR -93/106b和MCM7的表达 购置miRNA芯片进行检测，每张芯片对同一样本重复检验4次，取细胞样本的RNA进行荧光标记，浓缩样本后进行芯片的杂交，具体步骤按各试剂说明书进行，杂交后的芯片进行图像扫描，对所得数据进行分析。

　　1.2.5RT-PCR检狈0 VEGF、TNF-a、miR-93/106b和MCM7的表达 采用RT - PCR方法检测。应用Primer5.0软件版自行设计特异性引物，VEGF: 3'-GCTGGAArlTATTCATCGGGAC一5', 3 7- (;Arl、GAC_CTcccCrccrrCTC一5 7,159 bp;TNF -Ⅸ：3 7-crrc_CTATGTCGCCTTCACTCC - 5',3 7- GCACA(;ACGGGT-CATTCCAC -5’. 137 bp; MCM7:3’- AACCAG-GAAACGCAAACAGAG - 5', 3 7-TTC ACCA‘I'TCGGT-CAATCAGA-5’.192hp.miR - 93:3 7- (;CACGrl'TA_AATTCAACCCCAC -5’, 3’-GA AC;TCC'rccccrrcjCT_CAG-5', 139 bp; miR-106b: 3'_TCTG(j'rJlYFAAA_CATGGCCAG - 5,,3 7一GAAT(;ACCTCAA'11CCTCAG一5，，123 bp。首先制备RNA，然后进行转录反应7|。PCR反应条件‘8l: 95℃预变性5 min，95℃变性反应45 s，52℃条件下退火45 s.72℃延伸反应1.5 min，重复35个循环，72℃延伸反J\\i l5 rnin，然后进行PCR扩增，扩增后采用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物。控制电泳电压100V，将电泳胶放人凝胶成像系统观察结果并照相。

　　1.3 治疗方法将患者按术前3个月是否接受激素治疗分为未治疗组和治疗组，末治疗组以米次月经日期为基础，分为卵泡期、黄体期和异常子寓出血。治疗组包括接受CnRH受体激动剂、安宫黄体酮及|1服避孕药者。比较未治疗组和治疗组平滑肌瘤组织之间以及平滑肌瘤组织和子宫肌层组织r}，VECl:、TNF-仪、miR-93/106b和MCM7的表达水平，采』}j实时荧光定量PCR分析。

　　1.4统计学分析 所有资料及数据均输入计算机，运用SPSS 19.0统计学软件进行统计学处理，所有数据均符合正态分布，计量资料以(i±s)表,数据比较采用f检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 两组研究对象VEGF、rI'NF -仪、miR - 93/106b和MCM7表达量的比较(nl]RNA芯片检测) rniRNA芯片检测结果显示，病例组VEGF、TNF -仅、miR-93/106b和MCM7的表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组miRNA芯片检测结果见表1。

　　对照组

　　￡值

　　100 1. 06+0. 24

　　26. 356

　　1. 01+0. 21

　　22. 210

　　1. 14 +0. 23

　　29. 374

　　1. 08+0. 26

　　24. 694

　　1. 02t0. 23

　　18. 302

　　P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

　　2.2 两组研究对象VEGF、TNF一仪、miR - 93/106b和MCM7表达量的比较(RT-PCR检测) PT-PCR检测结果显示，病例组的VF,GF、rl'NF -仅、miR -93/106b和MCM7的表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

　　2.3 未治疗组与治疗组患者VEGF、TNF -仪、miR-93/106b和MCM7表达量的比较 治疗组MCM7表达水平升高，miR - 97表达水平减低，VEGF.TNF-a的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0. 05)。见表3。

　　治fr组 s0 2.21+0.21 2.36+0.36 l.25+0.25 1.32+0.34 2.65+0.69

　　t值 5.131 7.182 15.980 17.512 9.764

　　P值 0.0000 0.000 0.000 0.000 0.000

　　3讨论

　　miRNA是一类非编码单链小分子RNA，可以参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及迁移等多种生理过程[8]。子宫肌瘤发生发展中miRNA起到重要作用，以调控细胞转化、组织重构、血管生成及炎症反应。但尚无miR-93、miR-106b在子宫肌瘤组织中表达的研究，多见于其他肿瘤的报道。本研究探讨miR - 93、miR-106b在子宫肌瘤中的表达意义，并分析VEGF、TNF-a和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达。

　　在平滑肌瘤组织中，miR - 93表达降低，而MCM7表达升高，其基本不受种族及激素的影响[9]。有研究r10]报道子宫肌瘤患者组织中miR -93的表达降低，而MCM7表达升高，说明miR-93和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达存在一定差异。有研究报道[11-12]显示，miR -93、miR - 106b在子宫肌瘤引发的炎症反应中起重要作用。本研究结果显示，子宫肌瘤患者miR-93、miR -106b的表达量高于正常子宫组织。

　　VEGF是目前发现的重要的一种血管生成因子，具有促进血管内皮细胞增殖、增加血管通透性、参与内膜血管生成的作用。子宫肌瘤内皮增生及血管生成后会导致VEGF表达增强，从而起到促进肌瘤生长的作用。因此VEGF的变化可以作为一个重要指标，调控子宫肌瘤的细胞增殖及转化，对子宫肌瘤的转归具有重要作用。本研究结果显示，子宫肌瘤组织中VEGF的表达量高于正常子宫组织。而且采用激素治疗后患者VEGF的表达量增加，因此激素对VEGF的表达具有重要影响。

　　TNF-a作为一种重要的炎症反应细胞因子越来越受到重视，被活化的吞噬细胞可以释放大量TNF-a，从而使子宫肌瘤组织中的细胞发生损伤，进而加剧疾病的发生，并将炎症反应的信息进行反馈，起到损伤效应[14-151。另外，TNF-a可通过调节VEGF的表达，从而间接发挥血管形成作用。当子宫肌瘤组织发生炎症反应后，TNF-a的表达会发生变化。本研究结果显示，子宫肌瘤组织中的TNF-a的表达量高于正常子宫组织，而且接受激素治疗后患者的TNF-a表达量增加，表明激素可以增加TNF-a的表达。

　　本研究收集有症状的子宫肌瘤患者，行子宫切除术的子宫平滑肌瘤及肌瘤旁正常的子宫肌层标本，对是否手术前进行激素治疗的子宫肌瘤患者组织中的VEGF、TNF-a、miR-93/106b和MCM7水平进行检测，发现子宫平滑肌瘤组织中MCM7表达水平升高，miR-97表达水平减低，VEGF、TNF -仪的表达水平升高，激素治疗对MCM7及miR-97表达结果影响不显著，对VEGF. TNF-a结果有影响。