miR-378对卵巢癌细胞增殖能力的影响

　　miR-378对卵巢癌细胞增殖能力的影响

　　陈小平，任新萍，杜依蓓，薛金玲盐城市第一人民医院妇产科，江苏盐城224000

　　摘要：目的探究微小RNA378(miR-378)与c-Myc表达的关系及其与卵巢癌细胞增殖能力的影响。方法培养对数生长期人卵巢癌细胞系SKOV3，慢病毒转染法外源性上调SKOV3细胞中n，iR-378的表达作为实验组，同时转染空白载体作为对照组，Taqman实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术检测两组细胞miR-378及c-Myc mRNA表达水平，免疫印迹实验(W。。te，nBolt)检测两组细胞c-Myc蛋白表达水平，CCK-8实验检测两组细胞增殖能力的情况，克隆形成实验检测两组细胞克隆形成能力的。情况。结果实验组miR-378的表达水平显著高于对照组细胞(P<0.001);实验组。-Myc mRNA表达水平显著低于对照组细胞(P<0.05);实验组c-Myc蛋白表达水平同样显著低于对照组细胞(P<0.05);实验组细胞增殖能力在48及72h时显著低于对照组细胞(P<0.05);实验组细胞克隆形成能力显著低于对照组细胞(P<0.01)。结论miR-378可能通过抑制原癌基因c-Myc的表达，介导卵巢癌细胞增殖能力的下调。

　　关键词：卵巢癌;微小RNA378; c-Myc基因;恶性增殖

　　中国图书分类号：R588.6文献标识码：A文章编号：1001-4411(2018)11-2562-04;doi：10. 7620/zgfybj.j.issn.1001-4411：20J8.11.54

　　卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌及子宫内膜癌，但其相关死亡率位居第一，是恶性程度高的妇科恶性肿瘤。因此明确影响卵巢癌细胞恶性行为的关键因素对于卵巢癌的诊治工作具有重要的指导意义。微小RNA (microRNA)是转录本长度为21-25 nt的RNA分子，其可通过表观遗传调控机制在机体内发挥广泛的生物学作用，miR-378作为microRNA中的一员被发现与多种恶性肿瘤的发生发展有关，但其对于卵巢癌细胞行为的影响及相关机制尚不明确，本研究通过体外实验等手段明确了miR -378对卵巢癌细胞增殖的影响，并对相关机制进行了初步探究，现将结果报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验细胞本研究实验细胞包括：人卵巢癌细胞系SKOV3(美国ATCC公司，HTB -77)及人肾上皮细胞系HEK293T(美国ATCC公司，CRL -3216)。

　　1.1.2实验试剂本研究试剂主要包括：胎牛血清( FBS)、DMEM高糖培养基及RPMI1640培养基(美国Gibco)，嘌呤霉素(美国Sigma)，转染脂质体Li-pofectamine⑧2000 Reagent(美国Thermo Scientific),慢病毒包装系统(北京合生基因)，miR-378过表达载体及空白载体(山东维真生物)，miR -378、c-Myc及内参基因p-Actin引物序列合成(上海生工生物工程)，DEPC水、TRIzolrM Reagent及RNA逆转录试剂盒(美国Invitrogen)，Taqman探针设计(美国Thermo)，Ripa裂解液及蛋白酶抑制剂(上海碧云天)，BCA蛋白定量试剂盒(上海歌凡生物)，ECL化学发光试剂盒(美国Thermo Pierce)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学)，c - Myc及内参基因p-Actin抗体(美国R&D Systems)：c- Myc抗体(MAB3696);B - Actin(MAB8929);鼠二抗Anti - Mouse IgG( HAF007)。

　　1.1.3实验仪器 本研究仪器主要包括：DM1000光学显微镜(德国Leica)，Allegra 64R高速低温离心机(美国beckman coulter)，Tl00 PCR仪(美国Bio- rad)，EC0 1.5超净工作台(美国Thermo)，C02生化培养箱(上海一恒)，Nanodrop微量分光光度计(美国Thermo)，ABI7500实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)，电泳仪、电泳槽及转膜槽等(上海天能仪器)，ChemiDoc MP化学发光成像系统(美国Bio -rad)，多功能酶标仪(美国Molecu-lar Devices)。

　　1.2实验方法

　　1.2.1 细胞培养及慢病毒转染法构建实验组及对照组细胞 SKOV3细胞常规采用RPMI1640培养基+10% FBS培养，HEK293T细胞常规采用DMEM高糖培养基+10%FBS培养，培养条件均为37℃，5 010C0：气体环境，相对湿度100%。慢病毒转染法：培养两组同源HEK293T细胞，分别通过慢病毒包装系统转染空白载体及miR-378过表达载体，转染过程中无血清处理细胞6h，48 h后收集细胞上清液，室温2 000 r/min离心10 min，收集上清液并过滤，得到两组病毒悬液。将RPMI1640培养基+10% FBS与病毒悬液1:1混合连续培养SKOV3细胞3d，1y,g/ml嘌呤霉素筛选细胞，包装空白载体病毒感染的SKOV3细胞作为对照组，包装miR-378过表达载体病毒感染的SKOV3细胞作为实验组，待细胞稳定生长后完成细胞系的构建。

　　1.2.2 Taqman实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测miR-378及c-Myc mRNA表达水平收集实验组及对照组细胞lxl06个左右，1 ml TRIzol试剂重悬细胞，进行总RNA的抽提，Nanodrop微量分光光度计检测细胞总RNA浓度，取1斗g总RNA及浓度62.5 nmol/L miR-378、c- Myc及p-Actin转录引物进行逆转录反应，得到两组细胞相应特异性cDNA模板，Taqman荧光探针检测两组细胞miR-378、c-Myc及p- Actin的Ct值，反应条件：预变性95℃10 min，95 0C变性5s后60℃延伸30 s，共40个循环。2(一△△CT)法计算两组细胞miR -378及c-Myc相对p-Actin的表达情况。

　　1.2.3 免疫印迹实验( Western Bolt)检测c-Myc蛋白表达水平 收集实验组及对照组细胞lxl06个左右，1 ml Ripa裂解液4℃裂解细胞2h，BCA法检测裂解液中蛋白浓度，取50 Vg总蛋白与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)缓冲液配置样品体系，行10% SDS-PAGE，蛋白转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2h，1：1 000 c-Myc抗体孵育52 kDa条带，1：1 0003-Actin抗体孵育42 kDa条带，室温，1 h;1：2 000鼠二抗孵育条带，室温，th;ECL化学发光液孵育条带，室温，Imin，ChemiDoc MP化学发光成像系统对条带行曝光显影，并进行灰度扫描。

　　1.2.4 CCK-8实验细胞增殖能力 以2 0001孔细胞浓度均匀接种实验组及对照组细胞于96孔板中，设置5个重复孔，于细胞贴壁后0.，24，48，72 h时，RPMI1640养基+10% FBS与CCK-8试剂5:1混合，替换原有培养基，设置调零孔，37℃孵育th后，多功能酶标仪检测样品孔吸光值(OD值)，以调零孔为内参，计算各样品相对OD值，以各时间点与Oh相对OD值的比值衡量两组细胞的相对增殖能力。

　　1.2.5克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 以2000/孔细胞浓度均匀接种实验组及对照组细胞于6孔板中，设置3个重复孔，常规培养细胞2周，等渗PBS洗细胞3次，10%甲醇溶液固定细胞10 min，0. 1%结晶紫染色细胞20 min.PBS洗净结晶紫，ImageJ软件进行克隆计数。

　　1.3统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，计量资料采用平均数±标准差(x+s)表示，两独立样本≠检验比较计量资料间的统计学差异，以P<o. p="" 05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 两组细胞miR-378及c-Myc mRNA表达水平及比较RT-qPCR结果显示实验组及对照组细胞miR-378表达水平分别为0. 343 +0. 051及0.070+0. 024.实验组显著高于对照组，两组比较，差异具有统计学意义(t=8. 389，P<o. p="" 05)。<="" 637，p

　　2.2 两组细胞c-Myc蛋白的表达及比较 实验组及对照组细胞c -Myc蛋白表达水平分别为0.461+0. 092及0. 685 +0. 104，实验组显著低于对照组，两组比较，差异具有统计学意义(扛2. 794，P<o. p="" 05)。见图1。

　　2.3 两组细胞增殖能力情况及比较 实验组细胞增殖能力在48 h及72 h时显著低于对照组细胞，两组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表l。

　　2.4 两组细胞克隆形成能力情况及比较 克隆形成实验结果显示实验组及对照组细胞克隆形成数分别为53. 00+14. 70及139. 40 +22. 80，实验组克隆形成数显著低于对照组，两组比较，差异具有统计学意义( t = 5. 738 , P<o. p="" 2。

　　对照组 实验组　　

　　图1两组细胞c-Myc蛋白的表达及比较

　　表l两组细胞各时期增殖能力情况及比较(x+s)

　　对照组 实验组

　　图2两组细胞克隆形成能力情况及比较(结晶紫染色，x200)

　　3讨论

　　MicroRNA是基因转录后调控的重要角色之一，参与机体发育、细胞分化和细胞信号传递等重要生物学过程，其作为基因表达的调节器，在恶性肿瘤发生发展中同样发挥着关键作用。51。miR -378作为其中一员，被发现参与影响多种肿瘤细胞的恶性行为：①Zhang等[61在研究中发现miR-378在结直肠癌组织中表达显著降低，且miR -378的低表达与患者预后

　　不良显著相关，另外体外实验发现miR -378可显著下调结直肠癌细胞中波形蛋白( Vimentin)的表达，从而抑制细胞侵袭迁移能力;②Fei等‘”发现miR -378在胃癌组织中表达下调，并可体外抑制细胞增殖及转移能力，以及促进细胞凋亡;Deng等也发miR-378在胃癌细胞系中表达下调，上调miR -378的表达后胃癌细胞增殖能力显著降低，且可促进胃正常上皮细胞的生长，其机制与周期蛋白依赖性激酶( CDK6)和血管内皮生长因子(VEGF)通路的抑制

　　有关;③Deng等发现miR-378可上调人脑胶质瘤细胞Sox-2的表达，促进其干细胞的特性的维持，导致细胞体内外增殖及转移能力的增强;④Browne等研究显示miR - 378在三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231表达显著低于MCF7细胞，表明miR -378与乳腺癌细胞恶性程度负相关，且发现miR-378可下调乳腺癌细胞中原癌基因Runxl转录因子的水平，进而抑制细胞转移能力;⑤Chen等在非小细胞肺癌脑转移组织中发现miR-378表达的上调，且可体外促进肺癌细胞的转移及血管生成;Skrzypek等研究发现miR-378可上调肺癌细胞VEGF及白细胞介素IL-8的表达，促进细胞增殖转移及血管生成，且miR-378高表达于淋巴结转移肺癌组织，提示miR-378可促进肺癌的进展。以上研究表明miR-378对不同来源的恶性肿瘤存在促癌与抑癌的双重作用，但其与卵巢癌发生发展的关系尚不明确，基于此，我们通过体外实验探究了miR -378对卵巢癌细胞增殖能力的影响及相关机制。

　　本研究结果显示，外源性上调miR -378的表达后，卵巢癌细胞SKOV3增殖及克隆形成能力均显著减弱，提示miR-378对卵巢癌细胞生长的抑制作用。进而我们对相关机制进行了探究，c - Myc是Myc基因家族的一种可易位基因，其可促进细胞分裂，是细胞永生化的重要调节因子，与多种肿瘤细胞生长及恶性转化密切相关[13-14]，本研究中发现miR-378可抑制c-Myc mRNA及蛋白表达，提示miR-378可通过转录或转录后调控机制，下调卵巢癌细胞c - Myc的表达，进而发挥抑制细胞增殖的生物学作用。我们将通过进一步实验探究miR-378对(：- Myc表达影响的具体机制，明确其相互作用位点，为揭示miR -378在卵巢癌诊治工作中的应用价值提供新的依据。