MTHFR、MTRR基因多态性及Hcy水平与胎儿先天性心脏病的相关性

　　MTHFR、MTRR基因多态性及Hcy水平与胎儿先天性心脏病的相关性

　　王淑媛1，黄京希1，王静1，鲁衍强2，叶凤梅2

　　1.湘潭市妇幼保健院优生遗传科，湖南湘潭411100;2.上海靶向分子医学研究所，上海200433

　　摘要：目的研究MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点变异及孕期Hcy水平与胎儿先天性心脏病(CHD)的关联性。方法选取2013年1月- 2016年6月湘潭市妇幼保健院定期产前检查的202例单胎妊娠健康孕妇为研究对象，其中CHD胎儿孕妇102例为病例组，正常胎儿孕妇100例为对照组，采用荧光定量PCR方法检测其基因型，化学发光法测定血浆同型半胱氨酸( Hcy)水平。结果 MTHFR C677T位点两组基因型频率分布差异有统计学意义(P<0.05)，cT和TT型孕妇生育CHD胎儿的风险是CC型的2.450倍和7.688倍。T等位基因的孕妇生育CHD胎儿的风险是C等位基因的2.217倍;MTHFR A1298C位点基因型和等位基因分布两组比较差异无统计学意义(均P>0. 05);MTRR A66G位点两组基因型频率分布差异有统计学意义(P<0.05)，AG和GG型孕妇生育CHD胎儿的风险是AA型的2.731倍和4.412倍。G等位基因的孕妇生育CHD胎儿的风险是A型的2. 635倍;病例组孕妇Hcy水平高于对照组(P<0.05);联合变异孕妇生育CHD胎儿的风险是单一位点变异的3.355倍，是无变异的6. 959倍，联合变异孕妇Hcy水平高于单一位点变异和无变异者(均P<o. p="" c677t、mtrra66c位点变异及孕期hcy水平升高是生育chd胎儿的危险因素。mthfr和mtrr基因联合变异对孕期hcy水平的影响更大，生育chd胎儿的风险更高。

　　关键词：先天性心脏病;亚甲基四氢叶酸还原酶;甲硫氨酸合成酶还原酶;同型半胱氨酸;基因多态性

　　中国图书分类号：R17文献标识码：A文章编号：1001 4411( 2018) 11-2519 -04：doi:10. 7620/zgfybj.j.issn.1001-4411. 2018.11.40

　　基金项目：中国疾病预防控制中心妇幼保健中心妇幼保健分子遗传医学研究专项计划(FY-ZX-ZD-0018);2014年湘潭市科技计划项曰( ZJ2014017)

　　先天性心脏病( CHD)是心脏及大血管在胎儿期发育异常所致的先天畸形，部分严重的胎儿CHD在官内或新生儿期死亡。因此，胎儿CHD的类型与儿童期不同，是导致围生儿、婴幼儿死亡的重要原因，目前病因不明，预防措施较少。以往的研究多为儿童CHD与父母亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、甲硫氨酸合成酶还原酶( MTRR)基因位点变异及血浆同型半胱氨酸( Hcy)水平的相关性研究。但孕期母体的Hcy代谢异常，所致的宫内环境异常与CHD的发生关系更密切。本研究对孕妇MTHFR基因C677T位点和A1298C位点、MTRR基因A66G位点变异及孕期Hcy水平与胎儿CHD的相关性进行探讨。

　　1对象与方法

　　1.1 对象选取2013年1月-2016年6月在湘潭市妇幼保健院进行定期产前检查的202例单胎妊娠健康孕妇为研究对象。根据是否为妊娠CHD胎儿将研究对象分为病例组和对照组。病例组102例，年龄( 25. 58+5. 36)岁，孕周(22. 05+0. 91)周，胎儿均经染色体检查排除染色体病等综合征型CHD。其中，室间隔缺损25例，法洛氏四联征14例，心内膜壁缺损8例，房间隔缺损6例，主动脉辨或弓狭窄5例，右室双出口5例，肺动脉狭窄4例，大动脉转位4例，房室瓣重度反流4例，单腔心3例，左右心发育不良3例，复杂型心脏病16例，肺动脉闭锁2例，永存动脉干2例，心脏横纹肌瘤1例。随机选取同期经超声诊断胎儿发育正常(出生后随访正常)的100例孕妇为对照组，年龄( 26. 20 +4. 54)岁，孕周( 21. 77+0. 81)周。两组孕妇年龄及孕周比较差异无统计学意义(均P>O. 05)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因型检测 经研究对象知情同意后，采集口腔黏膜上皮细胞，提取样本基因组DNA。荧光定量PCR方法检测MTHFR C677T、A1298C和MTRRA66G位点基因多态性。每个反应体系10 111: DNA模板(20m∥L)1¨l，Taqman-MGB探针0.5肌l，Taq-man Universal Master Mix 5¨l，超纯水3.5¨l。PCR反应程序：95℃预热10 min; 92℃变性15 s，60℃延伸1min，20个循环;89℃变性15 s，60℃延伸1 min 30 s;30个循环。反应完成后，读取样品终点荧光，软件分析确定各位点基因型。所使用的仪器、试剂均为美国ABI公司提供。

　　1.2.2血Hcy水平检测 取受检孕妇空腹静脉抗凝血3 ml，30 min后3 000 r/min离心10 min，并分离血清，采用化学发光法进行检测，试剂盒为德国BAYER公司提供。

　　1.3统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，通过f检验对一般情况(孕周、年龄)进行均衡性检验。应用拟合优度爿2检验对照组基因型分布是否符合Hardy -weinberg遗传平衡。利用x2检验比较两组各位点等位基因及基因型频率，计算相对危险度OR值以及95% CI。P<o. p="" 05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1Hardy - Weinberg遗传平衡检验 使用Hardy -Weinberg遗传平衡检验对两组人群3个位点的基因型分布进行平衡检验，结果显示两组各基因型频率分布均符合Hardy - Weinberg遗传平衡(P>0.05)，样本具有群体代表性。

　　2.2两组孕妇3个位点基因型分布与等位基因频率比较

　　2.2.1 MTHFR C677T位点 两组孕妇的基因型频率分布相比差异有统计学意义(X2= 15. 489，P=0. 000)，与CC基因型比较，携带CT和TT基因型孕妇生育CHD胎儿的风险增加(X2=8. 930、11. 238，均P<o. 0="" 545，p

　　表1 两组MTHFR C677T位点基因型分布和等位基因频率比较[例(%)]

　　2.2.2 MTHFR A1298C位点 两组基因型频率分布和等位基因频率分布差异无统计学意义(X2=0. 379，P>O. 05)，与AA基因型比较，AC或CC基因型频率两组间差异无统计学意义(X2=0. 282、0.156，均P>O. 05)。A等位基因与C等位基因比较，差异无统计学意义(X2=0. 351.P>O. 05)。见表2。

　　表2 两组MTHFR A1298C位点基因型分布和等位基因频率比较[例(%)]

　　组别 例数

　　MTHFR A1298C

　　AA AC CC A C

　　病例组102 57( 55. 88) 40( 39. 22)5(4.90) 154( 75. 49) 50( 24. 51)

　　对照组100 60( 60. 00) 36( 36. 00)4(4.00) 156( 78. 00) 44( 22. 00)

　　2.2.3 MTRR A66G位点 两组孕妇的基因型频率分布相比差异有统计学意义(X2= 13. 953，P=0.001)，携带AG和GG基因型孕妇生育CHD胎儿的风险是AA基因型的2.731倍(X2= 9.788，P<0.05，95% CI=1.442~5.173)和4.412倍(X2=6. 856,P<o. p="" 0="" p<o.="" ci="1." 314)。见表3。

　　表3 两组MTRR A66G位点基因型分布的等位基因频率比较[例(%)]

　　2.3 两组孕妇血浆Hcy水平比较病例组孕妇的血浆Hcy水平(9. 50+4. 20) p.mol/L，明显高于对照组的(5. 89+2. 41) pdmol/L，两组比较差异有统计学意义(t=7.463.P<o. p="" 01)。

　　2.4 两组孕妇联合基因变异频率比较将3个位点的不同基因变异组合方式分为3种情况，分析1个位点变异和联合变异的分布频率在两组中的差异。与无变异比较，两组间1个位点变异分布频率差异无统计学意义(X2=2. 284，P>O. 05)，联合变异两组间差异有统计学意义(P=0. 000);联合变异孕妇生育CHD胎儿的风险是无变异孕妇的6.959倍(X2=18. 029, P=0.000, 95% CI=2.663~18. 184),1个位点变异的3. 355倍(X2= 14. 799，P=0.000,95% CI=1. 793~6.277)。见表4。

　　表4两组3个位点联合基因变异分析[例(%)]

　　2.5 3个位点的不同基因变异组合对孕妇血浆Hcy水平的影响孕妇血浆Hcy水平在联合变异、1个位点变异与无变异组之间的差异有统计学意义(P<0. 05)，血浆Hcy水平分别是联合变异>1个位点变异>无变异。见表5。

　　表5不同基因变异组合方式对Hcy水平的影响(x+s)

　　注：a.与1个位点变异比较;b.与联合变异比较;c.与无变异比较。

　　3讨论

　　MTHFR和MTRR是参与Hcy代谢的关键酶，这些酶基因位点的变异使酶活性降低，Hcy向甲硫氨酸转化出现障碍，导致高Hcy血症。MTHFR C677T位点变是MTHFR基因常见的变异类型，它使编码的氨基酸序列改变，缬氨酸取代丙氨酸，导致MTH-FR活性下降。MTHFR C677T位点‘rT基因型比CC基因型的酶活性下降600'/0~70%。11。关于该位点变异与子代CHD的关联国内外已有研究。Van - Bey-mum等认为母亲MTHFR基因C677T变异是子代CHD的危险因素;霍晓旭等对1 172例CHD患者的母亲进行Meta分析发现，母亲MTHFR基因C677T变异与子代患CHD有关，母亲携带TT基因型是其子代患CHD的危险因素。

　　MTHFR基因的另一个常见变异是A1298C位点变异，编码后谷氨酸被丙氨酸替代，Rudcl等M]研究发现，A1298C突变纯合子编码的酶活性只有野生型活性的60%。关MTHFR A1298C位点的研究多为该位点与患CHD关系的研究，与子代CHD关系的研究较少。Christensen等[5]研究显示，母亲MTHFR A1298C杂合子增加子代患主动脉狭窄的风险。而Hobbs等认为，MTHFR A1298C突变可能对子代发生CHD具有保护作用。本研究显示，与AA比较，携带AC及CC基因型的孕妇生育CHD胎儿的风险两组间差异无统计学意义(P>0.05)。与前面的研究结论不一，考虑可能与研究对象及样本大小不同有关，CHD是多基因遗传病，相关位点的变异在疾病发生中的作用同时受环境等其他因素的影响。

　　MTRR基因定位于5p15.31，常见的变异为66A>G，导致编码的甲硫氨酸被异亮氨酸所取代，使甲硫氨酸合成酶的活性降低。Van - Beynum等门1对荷兰169例CHD患儿和213例正常对照的研究显示，在维生素B12缺乏的情况下，母亲MTRR66GG基因型可增加子代患CHD的风险。宫婷等㈤J对60例CHD患儿及其母亲和60例正常对照的研究显示，母亲MTRRA66G位点变异会明显增加子代患CHD的风险。

　　关于3个位点联合变异与子代CHD的关系以往研究较少。李栋等研究显示，MTHFR基因C677T与A1298C位点对CHD的发生有协同作用。Zidan等[10]发现，MTHFR C677T与A1298C位点同时变异时会使酶的活性受到严重影响，导致血浆Hcy水平大幅升高。本研究显示，孕妇血浆Hcy水平在联合变异、1个位点变异和无变异组孕妇间差异有统计学意义(P<0.05)，联合变异组孕妇的血浆Hcy水平更高，生育CHD胎儿的风险大于1个位点变异和无变异者。提示3个位点变异对胎儿CHD的发生存在协同作用，联合变异的致病力增加，使血浆Hcy水平的升高更明显。

　　动物实验[ll]证明，高Hcy对孕鼠胚胎心脏发育有毒性作用，可诱导大鼠胚胎心肌细胞发生凋亡。Kim等[12]研究发现，当Hcy升高时，p66shc的表达上调，导致内皮细胞功能障碍，对心脏大血管的内皮细胞产生影响。孕妇血浆Hcy升高时(>14.3lt.mol/L)，生育CHD的风险是正常孕妇的3倍[13]。本研究也显示病例组孕妇血浆Hcy浓度高于对照组。母体高Hcy血症，形成官内高危环境，影响胎儿心脏神经嵴细胞的生长与分化，干扰心肌细胞凋亡，影响心脏大血管的内皮细胞功能，直接或间接导致胎儿CHD。因此，对孕前及孕早期妇女进行MTHFR基因C677T位点和A1298C位点、MTRR基因A66G位点基因型检测，筛选生育CHD胎儿高危人群，监测高危人群血浆Hcy水平，进行个体化干预，对降低胎儿CHD的发生有积极的作用。

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