活体观察不同月龄阿尔茨海默病模型小鼠视网膜AI3斑

　　活体观察不同月龄阿尔茨海默病模型小鼠视网膜AI3斑

　　秦熙，卢 艳

　　基金项目：北京市科委首都特色基金项目( No.2141107002514116)

　　作者单位：(100038)中国北京市，首都医科大学附属北京世纪坛医院眼科

　　作者简介：秦熙，毕业于首都医科大学，硕士研究生，住院医师，研究方向：青光眼、神经眼科。

　　通讯作者：卢艳，医学博士，主任医师，主任，教授，硕士研究生导师，中国医师协会青光眼委员会委员，中华医学会眼科分会神经眼科学组委员，北京医学会眼科学会委员，研究方向：青光眼、神经眼科.louiselu1964@ 163. com

　　收稿日期：2018 -03 -14 修回日期：2018 -09-05

　　Observation of [3 - amyloid plaques in retinas from live Alzheimer's model mice in different months

      Xi Qin, Yan Lu

　　Foundation item:Project Supported by Beijing Municipal Science & Technology Commission ( No. 2141107002514116)

　　Department of Ophthalmology, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

　　Correspondence to:Yan Lu. Department of Ophthalmology, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038,China. louiselu1964@ 163. com

　　Received :2018 -03 -14 Accepted :2018 -09 -05

　　Abstract

　　. AIM: To study the correlation of p - amyloid ( A[3 )plaques in retinas from Alzheimer's model mice in different months and progression of disease.

　　.METHODS: Six-month ( n=6) and twelve-month ( n=6) old Alzheimer's model mice, together with six-month (n=6) and twelve-month (n=6) old C57 mice were in this experiment. Morris water maze test was to assess the spatial memory. After intragastrical administration of curcumin for consecutive three days, the Ap plaques in retinas (n= 48) from all mice ( n= 24) were detected by noninvasive in vivo optical imaging.

　　*RESULTS: Morris water maze test: compared with the six- month control group ( C6) , six- month model mice (AD6) swam longer ( P< 0. 05); and AD6 swam longer distance and experienced more crossing times than C6 ( P>O. 05 ) ; compared with the twelve - month control group ( C12) , twelve- month model mice ( AD12) swam longer, swam longer distance ( P<0.05) and experienced more crossing times ( P>O. 05) ; compared with the six- month model mice ( AD6), twelve - month model mice

( AD12 ) swam longer, swam longer distance and experienced more crossing times ( P<o. p="" moreover,1782 the result of retinal A[3 plaques: We identified retinal A[3 plaques in postmortem from AD6 and AD12. Two six- month model mice had been detected retinal Ap plaques,thus the positive rate of retinal Ap plaques in six-month model mice was 33% ; And six twelve-month model mice had been detected retinal Ap plaques, thus the positive rate of retinal A[3 plaques in twelve-month model mice was 100% ; Plaques were undetectable in age- matched non-AD individuals neither in six- month or in twelve-month; the positive rate of retinal Ap plaques in AD12 was higher than AD6 ( P<0.05).

　　. CONCLUSION: Six - month model mice ( AD6 ) had already a decline of cognition; and the illness gradually increased with the extension of the disease, and the positive rate of retinal Ap plaques is increasing with progression of Alzheimer's disease.

　　. KEYWORDS:Alzheimer's disease; animal model; morris water maze test; curcumin; noninvasive optical imaging

　　Citation:Qin X, Lu Y. Observation of [3 - amyloid plaques in retinas from live Alzheimer's model mice in different months. Cuoji Yanke Zazhi( Int Eye Sci ) 2018 ;18 ( 10 ) : 1782-1785

　　摘要

　　目的：观察不同月龄阿尔茨海默病( AD)模型小鼠视网膜A[3斑阳性率与AD病程的相关性。

　　方法：6、12月龄APP/PS1模型小鼠各6只，同月龄同背景非转基因C57小鼠各6只为正常对照。各组小鼠均进行水迷宫实验，检测空间学习记忆能力。姜黄素溶液连续灌胃3d，对24只48眼小鼠行眼底自发荧光照相检查，观察视网膜Ap斑。

　　结果：水迷宫试验：与6月龄对照组( C6)相比，6月龄AD模型小鼠( AD6)游行时间显著增加(P<0.05)，游行路径长度及穿越站台次数也显著增加(P>0.05);与12月龄对照组( C12)相比，12月龄AD模型小鼠(AD12)游行持续时间、路径长度均显著增加(P<0.05)，穿越站台次数也显著增加(P>0.05);12月龄AD小鼠( AD12)与6月龄AD模型( AD6)小鼠相比，12月龄AD小鼠(AD12)游行持续时间、路径长度及穿越站台次数均显著增加(JP<0.05)。姜黄素标记联合眼底自发荧光照相结果：AD6、AD12的视网膜后极部检测到了AB斑：6月龄AD模型小鼠中有2只小鼠出现了视网膜A[3斑，视网膜AB斑阳性率为33%12月龄AD模型小鼠中有6只小鼠出现了视网膜A(3斑，视网膜AB斑阳性率为100 010;C6、C12均未检测出视网膜A(3斑;12月龄AD模型小鼠眼底A[3斑阳性率明显高于6月龄AD模型小鼠(P<0.05)。

　　结论：6月龄AD模型小鼠已有认知功能障碍，且随着病程的延长病情逐渐加重，视网膜AB斑的阳性率也逐渐增加。

　　关键词：阿尔茨海默病;动物模型;水迷宫;姜黄素;眼底自发荧光照相

　　引用：秦熙，卢艳.活体观察不同月龄阿尔茨海默病模型小鼠视网膜A[3斑，国际眼科杂志2018;18 (10)：1782-1785

　　0引言

　　阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD)是一种年龄相关的神经退行性疾病，其标志性病理表现为中枢神经系统的A[3蛋白沉积和细胞内Tau蛋白过度磷酸化导致的神经元纤维缠结，会出现记忆力下降、认知功能障碍及视功能下降等临床表现。AD患者会出现视野缺损旧1、对比敏感度下降口1等视功能异常的症状，在既往的研究中发现AD患者视网膜神经纤维层变薄Hj、黄斑容积变小等异常改变。通过对AD模型小鼠的免疫组织学研究，证实了视网膜上同样出现了A[3斑。上述证据表明视网膜也成为AD的受累器官。由于阿尔茨海默病存在起病隐匿、不可逆的特点，因此及时地诊断及干预治疗可延缓病情进展，从而减轻家庭及社会负担。目前对于AD的诊断主要依据MRI、脑脊液AB蛋白、Tau蛋白以及PET对A[3蛋白的检测，但由于上述方法有创、昂贵等不足一1，未能广泛普及。而视网膜较大脑拥有更为便利、直观的优势来观察组织病变情况，越来越多的学者致力于探究视网膜是否

　　能够作为AD诊断的新平台。目前已有研究发现，利用姜黄素标记联合眼底自发荧光照相技术在活体状态下标记出视网膜A(3斑哺1，这使得通过检测视网膜A(3斑作为AD诊断新标准成为可能。那么，视网膜AB斑的阳性率与AD疾病进展程度存在何种关系呢?本研究旨在观察不同月龄APP/PS1双转基因模型小鼠视网膜A[3斑的阳性率与AD病程是否存在相关性。

　　1材料和方法

　　1.1材料6、12月龄APP/PS1双转基因雌性小鼠(AD模型小鼠)及同月龄同背景非转基因C57雌性小鼠(C57小鼠)作为本实验的实验对象(所有小鼠均购自中国医学科学院实验动物研究所)，每组6只。动物实验经首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准。

　　1.2方法

　　1.2.1 Morris水迷宫实验 对AD模型小鼠及C57小鼠分别进行Morris水迷宫实验。首先对每只小鼠进行游泳及寻找站台训练3d，3d后正式进行水迷宫实验，持续3d，每日1次。记录并计算小鼠在120s内的游泳时间、游泳轨迹以及穿越站台次数。

　　1.2.2配制20mg/mL姜黄素溶液 购买第三代姜黄素复合物( Curcumin C3 Compelx)作为原材料，将400mg姜黄素溶于4. 8mL 0.Olmol/L NaOH溶液中，PBS液稀释至20mL，配成20mg/mL姜黄素溶液，酸碱度pH=7.4~7.8。配制好的溶液避光保存。

　　1.2.3姜黄素灌胃 灌胃前对每只小鼠称重，按7. Smg/(kg.d)剂量对每只小鼠行姜黄素溶液灌胃，连续灌胃3d，3d后再次称重。

　　1.2.4眼底自发荧光照相 对每只小鼠进行0.5%复方托吡卡胺散瞳和10%水合氯醛4mU kg腹腔麻醉，麻醉后对其进行眼底自发荧光照相(海德堡二代)，观察视网膜后极部血管及视盘区域的A[3斑。双眼中如有1眼视网膜出现AB斑即认为Ap斑阳性。

　　表1 四组小鼠Morris水迷宫游泳时长、游泳路长及穿越站台次数对比结果 x+s

　　120 100 80 60 40 20 0

　　AD6 C6 AD12 C12

　　图1 四组小鼠游泳时长对比。

　　统计学分析：采用统计学软件SPSS17.0分析，水迷宫实验的游泳时间、游泳路长及穿越站台次数用均数±标准差(x+s)表示，采用独立样本￡检验;视网膜Ap斑阳性率比较采用Fisher确切概率法，P<o. p="" 05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 Morris水迷宫实验各组小鼠游泳时长、游泳路长及穿越站台次数见表1，图1—3。与C6相比，AD6游行时间、路径长度及穿越站台次数显著增加，游行时间差异有统计学意义(P<0.05)，路径长度及穿越站台次数差异无统计学意义(P>0.05);与C12比，AD12游行时间、游行路长及穿越站台次数显著增加，游行时间及游行路长差异有统计学意义(P<0.05);与AD6相比，AD12游行持续时间、路径长度及穿越站台次数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05);与C6相比，C12游行时间、路径长度及穿越站台次数显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2眼底自发荧光照相结果 四组小鼠视网膜A[3斑阳性率比较结果见表2。AD6视网膜A[3斑阳性率为33 010，AD12视网膜A[3斑阳性率为100%，C12、C6均未检测出视网膜A[3斑。AD6视网膜A[3斑阳性率高于C6，差异无统计学意义(P=0. 121);AD12视网膜Ap斑阳性率高于C12，差异有统计学意义(尸=0.001);AD12视网膜A[3斑阳性率高于AD6，差异有统计学意义(尸=0.014)。各组小鼠眼底自发荧光照相图片见图4。

　　图3 四组小鼠穿越站台次数对比。

　　图4小鼠眼底自发荧光照相A:6月龄AD模型小鼠，红色箭头所指高荧光为A[3斑;B:6月龄对照组小鼠;C:12月龄AD模型小鼠，红色箭头所指高荧光为AB斑;D：12月龄对照组小鼠。

　　表2 24只小鼠视网膜Ap斑阳性率比较

　　3讨论

　　阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其发病机制尚未完全明确，目前存在多种假说：有B样淀粉样蛋白级联假说、神经炎症反应基因突变等，这些假说均表明神经细胞产生了神经毒性反应，从而出现AD症状。视网膜与中枢神经系统有着相似的解剖结构，在AD患者的尸检报告中发现了视网膜AB斑。同时，在免疫组化的研究中，也发现了其外核层至神经节细胞层均有AB蛋白的聚集∞1，从而出现视网膜神经纤维层变薄H1、黄斑容积变小等异常改变。同时，李臻等[11]在观察AD小鼠视网膜超微结构变化时发现AD模型小鼠视网膜各层均出现了神经退行性病变，也由此提示我们视网膜可以作为AD诊断新窗口。

　　眼球特有的屈光介质使得我们可以通过非接触的眼科检查仪器观察到视网膜的病变情况。Koronyo - Hamaoui等∞。利用姜黄素对不同病程的AD患者进行尸检，发现正常老年人大脑无A(3斑块沉积，同样在视网膜上也未发现A8斑块;大脑存在少量AB斑块但生前无AD症状的老年人视网膜上也发现了少量A[3斑块;而生前被确诊为轻度AD患者的大脑和视网膜上探测到了明显的A[3斑块;而且在生前被确诊为重度AD患者的大脑和视网膜上则同时发现了大量的A[3斑块聚集。实验说明了视网膜A[3斑块的分布量与疾病严重程度呈正相关。此外，Koronyo -Hamaoui还发现，2.5月龄的APPswe/PSl小鼠大脑组织尚未探测到A[3斑块沉积时，其视网膜上已可检测到AB斑块的存在，更新了以往研究证明AB斑块早出现于5月龄APPswe/PSl小鼠大脑组织的记录。这说明A[3斑块在视网膜上的沉积早于大脑组织，在AD的发病过程中视网膜可能先于大脑受累，这与李臻等[11]研究结果相一致。Koronyo-Hamaoui的研究同时也说明了姜黄素可以作为天然安全的荧光染料标记AB斑。

　　姜黄素，一种生姜提取物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保护神经等特性，同时，它也是安全有效的天然染料，能够特异性结合并标记AB蛋白。(1)抗A[3蛋白的产生和聚集：姜黄素能够下调淀粉样前体蛋白( APP)和早老素-1(PS-1)的表达，也可以抑制淀粉样前体蛋白裂解酶( BACEI)的表达，从而减少AB蛋白的产生[ 12]，从而保护神经细胞。(2)抑制神经细胞凋亡：糖原合成酶激酶3B(glycogen synthesis kinase 3[3，GSK-3p)在AD发病机制中起主要作用，它可以活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase -3)诱导神经细胞凋亡，姜黄素可以抑制GSK-3p活性，从而抑制GSK-3B诱导的神经细胞凋亡，同时姜黄素能够加强具有神经保护的丝氨酸一苏氨酸蛋白激酶( serine/threonineldnase，AKT)、转录因子Nr{2的表达，发挥神经保护作用13。(3)姜黄素作为一种姜黄染料，其与AB蛋白聚集形成的老年斑的自然亲和力，使得姜黄素成为安全的老年斑块荧光染料。

　　已有研究表明，APP、PS-1、PS-2基因突变会导致A[3蛋白聚集，促使形成老年斑，而PS-1会增强APP转基因小鼠体内A[3蛋白的聚集和细胞内Tau蛋白过度磷酸化过程，因此，本实验采用携带有突变人APP/PS1基因的双转基因小鼠，从而使AD模型小鼠能够很好地表现出AD的病理表现及临床特征。在实验之初对各组小鼠进行水迷宫实验，以此来检测各组小鼠的学习、记忆能力，判断其认知功能状态，从而评估病情进展情况。本实验结果显示了6、12月龄AD模型小鼠均出现了认知功能下降，且12月龄AD模型小鼠的认知障碍程度较6月龄的AD模型小鼠更为严重，从而证明了12月龄AD模型小鼠较6月龄AD模型小鼠的病情更为严重。众多研究发现，姜黄素能够和A[3斑特异性结合，利用这一特性，我们采用姜黄素标记联合眼底自发荧光照相技术，在活体AD模型小鼠的视网膜上成功标记出A[3斑，而在各对照组的视网膜上均未发现A(3斑，这与Koronyo - Hamaoui等利用姜黄素对AD患者及年龄匹配的正常人进行尸检，在正常老年人视网膜上未发现A[3斑块，而生前被确诊为AD患者的视网膜上探测到了明显的A[3斑块的研究结果相一致。此外，本实验研究结果发现，6月龄AD模型小鼠视网膜AB斑阳性率为33%，12月龄AD模型小鼠视网膜A(3斑阳性率为100%，12月龄AD模型小鼠视网膜A[3斑阳性率明显高于6月龄AD模型小鼠，且差异有统计学意义，由此说呢随着病情进展，视网膜AB斑阳性率也随之增加，进一步提示了姜黄素能够作为评估AD病情进展的生物标记物。

　　本研究的创新之处在于纵向比较了AD模型小鼠视网膜A(3斑的阳性率与AD病程的相关性;不足之处在于：(1)本研究有些结果可能会受样本量的限制受到影响，有待进一步扩大样本量来研究确证;(2)视网膜A[3斑的数量、大小与疾病进展程度存在何种关系有待进一步研究。6月龄、12月龄AD模型小鼠均出现认知功能障碍，且随着病程的延长病情逐渐加重。姜黄素标记联合眼底自发荧光照相，在活体状态下标记出6月龄、12月龄AD模型小鼠视网膜A[3斑，且随着AD病情的进展，AD模型小鼠视网膜A[3斑的阳性率增加。姜黄素标记联合眼底自发荧光照相为AD诊断及病情评估提供了新的方便快捷无创性手段。

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