HPLC波长切换法同时测定金衣万应丸中多种有效成分的含量

　　HPLC波长切换法同时测定金衣万应丸中多种有效成分的含量

　　·论著·

　　马丹凤1，李素娟2，刘雯3(1.湖南省儿童医院，湖南长沙410007;2.武汉市东西湖区人民医院，湖北武汉430040;3.武汉

　　市第四医院，湖北武汉430033)

　　[摘要]目的：建立同时测定金衣万应丸中儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的HPLC波长切换法。方法：选用Agilent TC-C18(250 mmx4.6 mm，5 ym)色谱柱;流动相：乙腈-0. 20/0磷酸溶液(梯度洗脱);流速0.9 mL/min;柱温30℃;进样量20 yL。结果：金衣万应丸中儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷1分别在6.12~ 122. 40、3.78~ 75. 60、3. 35~ 67. 00、12. 76~ 255. 20、8.94~ 178. 80 yg/mL浓度范围内线性关系良好，平均回收率(n=6)分别为98. 40%( RSD=1.71%)、97. 56%( RSD=1.24%)、96. 94%(RSD=0.88%)、100. 19%(RSD =0. 99qo)、98.97% (RSD=1.03%)。结论：该方法简便、准确、重复性好，可为金衣万应丸多指标质量评价提供参考。

　　[关键词]金衣万应丸;波长切换法;儿茶素;表儿茶素;胡黄连苷Ⅲ;胡黄连苷Ⅱ;胡黄连苷I

　　[中图分类号] R917 [文献标识码]A [文章编号l1672-108X(2018)06-0048-04

　　Simultaneous Determination on Effective Components of Jinyi Wanying Pills by HPLC Wavelength

　　Switching Method

　　Ma Danfeng' , Li Sujuan2 , Liu Wen3(i. Hunan Children's Hospital, Hunan Changsha 410007, China; 2. People's Hospital of Dongxihu District Wuhan City, Hubei Wuhan 430040, China; 3. Wuhan Founh Hospital, Hubei Wuhan 430033, China)

　　[Abstract] Objective: To establish the quantitative method of (+)-catechin, epicatechin, picroside m, amphicoside II and amphicoside I in Jinyi Wanying pills by HPLC wavelength switching method. Methods: The determination was performed on

　　chromatographic column of Agilent TC-C18 (250 mmx4.6 mm, 5 ym). The mobile phase consisted of acetonitrile ( A)-O. 20/o of phosphoric acid solution (B) with gradient elution. The flow rate was 0.9 mUmin. The column temperature was set at 30'C. The injection volume was 20 yL. Results: The concentration ranges of (+)-catechin, epicatechin, picroside m, amphicoside lI and amphicoside I were respectively 6. 12-122. 40, 3.78-75. 60, 3. 35-67. 00, 12. 76-255. 20, 8. 94-178. 80 pug/mL, with well linear relation. The average recovery of the above five components were 98. 40% ( RSD = 1. 71u/o ) , 97. 56qo ( RSD = 1. 24% ) , 96. 94% ( RSD= 0. 88qo ) , 100. 19% ( RSD = 0. 990/o ) , 98. 970/o ( RSD = 1. 03% ) , respectively. Conclusion:'This determination method is convenient and accurate, with good repeatability, which can provide references for multi-indices quality evaluation of Jinyi Wanying pills.

　　[Keywords] Jinyi Wanying Wan; wavelength switching method; (+)-catechin; epicatechin; picroside-lll; amphicoside II;amphicoside I

　　金衣万应丸配方源于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十三册，由胡黄连、儿茶、乳香(醋炙)、没药(醋炙)、牛胆粉、麝香、冰片和香墨等八味中药材加工而成。方中胡黄连退虚热、除骨蒸、凉血清热，为君药;儿茶活血止痛、止血敛疮，为臣药;冰片、麝香开窍醒神、清热止痛，乳香、没药、香墨、牛胆粉活血散瘀、定痛消肿，共为佐使。金衣万应丸方中诸药相合，共奏清热祛暑、解毒止血之功效，临床上主要用于内热引起的中暑头晕、上吐下泻、咽喉肿痛、口舌生疮、牙齿疼痛、吐血衄血、肠风便血、无名肿毒、小儿急热惊风等病症的治疗H1。胡黄连为玄参科植物胡黄连的干燥根茎，主要生物活性成分是环烯醚萜苷，包括胡黄连苷I、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ等;儿茶为豆科植物儿茶去皮枝干的干燥煎膏，主要含有儿茶素、表儿茶素、儿茶鞣质、儿茶酸等成分。2015年版《中国药典(一部)》对胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷I、儿茶素和表儿茶素进行了定量研究心。为进一步提高金衣万应丸的质量控制标准，笔者建立HPLC波长切换法同时对儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I进行测定。

　　1 仪器和试药

　　Waters 2695型液相色谱仪(美国);Sartorius BP211D型电子天平(德国);DL-360型超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)。金衣万应丸(北京同仁堂，每67粒重3g);儿茶素对照品(110877-201604)和表儿茶素对照品(110878-200102)，购自中国食品药品检定研究院;胡黄连苷Ⅲ对照品( 64461-95—6)、胡黄连苷Ⅱ对照品( 39012-20-9)和胡黄连苷I对照品(27409-30-9)，购自上海纯优生物科技有限公司;乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。

　　2方法和结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：Agilent TC-C18( 250 mmx4.6 mm，5 pum);流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液(梯度洗脱，以乙腈体积比计：0~ 11min,10%;11~19 min,10%—15%;19~ 34 min,15%~ 24%;34~40 min,24%~10%)‘引;0~19 min在280 nm波长下检测儿茶素和表儿茶素L8。9]，19~ 40 min在275 nm波长下检测胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I'101;流速0.9 mL/min;柱温30℃;进样量20卜LL。

　　2.2溶液的配制

　　2.2.1 对照品溶液精密称取儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I对照品适量，分别用50%甲醇溶解制备对照品储备溶液：儿茶素0.612 mg/mL、表儿茶素0. 378 mg/mL、胡黄连苷Ⅲ0.335 mg/mL、胡黄连苷Ⅱ1. 276 mg/mL、胡黄连苷1 0.894 mg/mL;依次量取2.5、2.5、2.0、5.0、2.5 mL至50 mL容量瓶，用50%甲醇定容，即得混合对照品溶液。

　　2.2.2供试品溶液取金衣万应丸适量研碎，取约0.5 g，精密称定，置于50 mL容量瓶，加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量。超声提取30 min，放冷，再称定重量。用50%甲醇定容，摇匀，过滤，制得金衣万应丸供试品溶液。

　　2.2.3 阴性样品溶液 按金衣万应丸的制备工艺，分别制备缺儿茶样品和缺胡黄连样品，再按照供试品溶液的制备方法制成儿茶阴性样品溶液和胡黄连阴性样品溶液。

　　2.3 专属性实验

　　精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、儿茶阴性样品溶液和胡黄连阴性样品溶液各20 pdL，分别进样检测，结果显示，儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的色谱峰能较好的分离，其他成分对目标成分的测定无干扰，目标成分峰理论塔板数均不低于3 500，分离度符合药典规定。见图1。

　　A.对照品;B.供试品;C.儿茶阴性样品;D.胡黄连阴性样品;

　　1.儿茶素;2.表儿茶素;3.胡黄连苷Ⅲ;4.胡黄连苷Ⅱ;5.胡黄连苷I

　　图1 专属性实验色谱图

　　2.4线性关系考察

　　精密量取对照品储备液10.0 mL至50 mL容量瓶中，摇匀，作为线性考察工作溶液I，再用50%甲醇分别稀释浓度至75%、50%、25%、10%、5%，依次制得线性考察工作溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ，进样测定。以浓度(x)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，逐一计算求得各目标成分的回归方程，见表1。

　　表1线性关系考察

　　成分 回归方程 线性浓度范围/( LLg/mL) r

　　儿茶素 y=1 138 200X -405.8 6.12~ 122. 40 0.999 9

　　表儿茶素 y= 791 740X -276.2 3.78~ 75. 60 0.999 3

　　胡黄连苷Ⅲ l，= 388 190X+360.9 3.35~ 67. 00 0.999 7

　　胡黄连苷Ⅱ l，= 953 270X -189.4 12.76~ 255. 20 0.999 5

　　胡黄连苷IY=1 380 600X+437.5 8.94~ 178. 80 0.999 6

　　2.5 重复性实验

　　取金衣万应丸(批号3085004)样品6份，制备供试品溶液，进样测定，分别计算儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的含量，求得RSD分别为1. 22%、0.57%、1.36%、0.91010和1.14%.

　　2.6精密度实验

　　取混合对照品溶液，连续进样6次，测定儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ：胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的峰面积，求得RSD分别为1.03%、0.91%、1.12u/o、0.67 010和0. 79 010。

　　2.7稳定性实验

　　取金衣万应丸(批号3085004)样品制备供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8、12、16 h时进样测定儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的峰面积值，结果各成分峰面积的RSD分别为1.01%、0. 54%、1.10%、0.700/0和0.98%，表明金衣万应丸供试品溶液在室温下16 h内性质稳定。

　　2.8加样回收率实验

　　取金衣万应丸(批号3085004)样品6份，每份约0. 25 g，研碎，精密称定，置50 mL量瓶中，依次加入儿茶素对照品溶液(0. 699 mg/mL)1.0 mL、表儿茶素对照品溶液(0.451 mg/mL) 1.0 mL、胡黄连苷Ⅲ对照品溶液(0. 289 mg/mL)1.0 mL、胡黄连苷Ⅱ对照品溶液(0.574

　　mg/mL)5.0 mL、胡黄连苷I对照品溶液(0.617 mg/mL)2.0 mL、50%甲醇40.0 mL，按照金衣万应丸供试品溶液制备方法制备加样回收率实验样品溶液。进样测定，计算儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的回收率及R.SD值。见表2。

　　2.9含量测定

　　取三个批号的金衣万应丸制备金衣万应丸供试品溶液，进样测定儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的含量。见表3。

　　3讨论

　　3.1 检测波长的选择

　　分别取儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I对照品溶液在200~ 400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果儿茶素和表儿茶素在281 nm波长处有大吸收，胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I在275 nm波长处有大吸收，同时参考2015年版《中国药典(一部)》儿茶药材项下儿茶素和表儿茶素的检测波长280 nm、胡黄连药材项下的胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I检测波长275 nm，终采用波长切换法在280 nm处检测儿茶素和表儿茶素，275 nm处检测胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I

　　表2加样回收率实验结果

　　成分 警样 样品含 加入 测得 回收 平均回RSD/

　　量/g 量/mg 量/mg 量/mg 率/% 收率/% %

　　0.250 7 0.699 5 0.699 0 1.400 7 100.31

　　0.248 6 0.693 6 0.699 0 1.392 6 100.00

　　0.7014 0.6990 1.379.9 97.07

　　儿茶素篡0.7050.6991.37796.17 蛆…，，.

　　0.705 3 0.699 0 1.377 5 96.17

　　0.249 3 0.695 5 0.699 0 1.389 1 99.23

　　0.250 1 0.697 8 0.699 0 1.380 4 97.65

　　0.250 7 0.453 8 0.451 0 0.900 6 99.07

　　0.248 6 0.4500 0.4510 0.895 3 98.74

　　表)1茶素 0.2514 0.4550 0.4510 0.8898 96.41

　　0.252 8 0.457 6 0.451 0 0.890 9 96.08

　　0.249 3 0.4512 0.4510 0.892 2 97.78

　　0. 250 1 0.452 7 . 0.451 0 0. 891 6 97. 32

　　0.250 7 0.293 3 0.289 0 0.575 1 97.51

　　0.248 6 0.290 9 0.289 0 0.568 5 96.06

　　胡黄连苷m 0.2574 0.2941 0.2890 0.5737 96.75

　　0.252 8 0.295 8 0.289 0 0.574 6 96.47

　　0.249 3 0.2917 0.289 0 0.576 0 98.37

　　0.250 1 0.292 6 0.289 0 0.5715 96.51

　　0.250 7 2.870 5 2.870 0 5.763 2 100.79

　　0. 248 6 2. 846 5 2. 870 0 5.751 0 101.20

　　胡黄连苷II 0.2514 2.8785 2.8700 5.7469 99.94

　　0.252 8 2.894 6 2.870 0 5.757 2 99.74

　　97. 56 1 24

　　96. 94 0.88

　　100. 19 0.99

　　0.249 3 2.854 5 2.870 0 5.750 8 100.92

　　0.2501 2.863 6 2.8700 5.6913 98.53

　　0.250 7 1.243 5 1.234 0 2.466 5 99.11 98.97 1.03

　　0.248 6 1.233 1 1.234 0 2.429 7 96.97

　　1.246 9 1.234 0 2.470 8 99.18

　　胡黄连苷一呈薹：：：乏 100.，，o.。。

　　1.253 9 1.234 0 2.479 5 99.32

　　0.249 3 1.236 5 1.234 0 2.463 0 99.39

　　0.250 1 1.240 5 1.234 0 2.472 8 99.86

　　表3含量测定结果 mg/g

　　样品批号儿茶素表儿茶素 胡黄连苷Ⅲ胡黄连苷Ⅱ胡黄连苷I

　　3085004 2. 79 1.81 1.17 11.45 4.96

　　3085010 2. 91 1.98 1.02 10.88 4.47

　　4075006 2. 69 1.73 1.30 11.169 5.42

　　平均含量2. 80 1.84 1.16 11.34 4.95

　　3.2流动相的选择

　　我们曾尝试采用等度洗脱对儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I进行同时测定，但分离效果不够理想，在此基础上对多个梯度流动相进行筛选，终选定乙腈-0. 2%磷酸溶液(梯度洗脱)。在此流动相条件下，色谱峰基线平稳，杂质峰少，目标成分峰分离效果良好。

　　3.3有效成分提取方法的选择

　　有效成分的提取方法考察了加热回流提取法和超声提取法，结果显示，超声提取法效果更好，且操作简便。在此基础上，再考察不同提取溶媒(30%甲醇、50010甲醇、70010甲醇)和不同提取时间(15、30、45 min)的提取效果，结果表明，50010甲醇超声提取30 min，可提取完全。

　　3.4含量测定结果分析

　　含量测定结果表明，不同批号的金衣万应丸中有效成分含量有一定差异。本研究建立了HPLC波长切换法同时测定金衣万应丸中儿茶素、表儿茶素、胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷I的含量，简便快捷，填补了金衣万应丸定量分析方面的研究空白，可为进一步完善质量标准提供参考。

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