叶酸对宫颈癌Caski细胞增殖及脆性组氨酸三联体基因表达的影响

　　叶酸对宫颈癌Caski细胞增殖及脆性组氨酸三联体基因表达的影响

　　禹志韫1陈江平2张凡1 1.张家口市崇礼区中医院妇产科，河北张家口076350;2.河北北方学院附属第一医院妇产张家门075000;3.河北北方学院附属第一医院病理科，河北张家口075000

　　摘要：目的探讨叶酸对宫颈癌Caski细胞增殖及脆性组氨酸三联体(F'Hrr)基凶表达的影响，为宫颈癌的临床治疗提供新的理论依据。方法以100、500、1 000 V,g/ml叶酸处理宫颈癌Caski细胞，分别设为低/中/高剂量实验组，对照组则以等镀牛理盐水处理，：于光学显微镜下观察并对比对照组及高剂量实验组宫颈癌Caski细胞形态。应用台盼蓝活细胞计数法检测各绀官颈癌Caski细胞增殖情况，应用RT-PCR检测各组宫颈癌Caski细胞FHIrr mRNA表达情况，应用Western  (JIling检测宫颈癌Caski细胞FHIT蛋白表达情况.、结果光学显微镜下可见高剂量实验组官颈癌Caski细胞数量明显减少，大量细胞悬浮，细胞质中颗粒增多，细胞形态不规则，、对照组及低/中/高剂量实验组活细胞数量分别为( 63. 79+1. 51)×l04个、(54.15+1.43) xl04个、(42. 34+1. 12) xl04个及( 32. 18+0. 96)×l04个;低/中/高剂量实验组宫颈癌Caski细胞增殖抑制率分别为(7.96+0. 86)%、( 21. 38+0. 91)%、(43. 51+0. 89)%。与对照组比较，低/f1/高剂晕实验组活细胞数量显著降低(均P<o.05)，且实验组活细胞数鲢随叶酸浓度的升高旱逐渐降低趋势(p<0.05)，而细胞增殖抑制率随叶酸浓度的升高呈逐渐升高趋势(p<0.05)。均随叶酸浓度升高呈逐渐升高趋势(P<0.05)，剂量实验组fhrrmrna及fhit蛋白相对表达量均显著升高。结论叶酸可显著抑制宫颈癌Caski细胞增殖，其作用机制可能与显著上调F'IHT表达相关。

　　关键词：宫颈癌细胞;叶酸;增殖;脆性组氨酸j联体;表达

　　中国图书分类号：R737. 33文献标识码：A文章编号：10014411(2018)10-2353-03;doi:10. 7620/zgfyOhj. jlb,sn. 1001 -4411. 2()1 8 10 60

　　宫颈癌是严重危害女性生理及心理健康的恶性肿瘤，早期患者无典型临床症状，多数患者就诊时已为中晚期，错失了佳治疗时间，因此整体治疗效果并不理想[1-3]。国内外研究[4-5]报道：叶酸可参与并调节DNA甲基化的生物学进程，叶酸缺乏、异常DNA甲基化均与宫颈癌发病密切相关，因此及时补充叶酸也可作为官颈癌治疗的有效措施之一。有研究[6-7]报道：脆性组氨酸三联体( FHIT)是一种新型的抑癌基因，参与多种恶性肿瘤的发生及发展过程，因此可作为检测宫颈癌治疗效果的可靠指标。本研究旨在探讨叶酸对宫颈癌Caski细胞增殖及FHIT表达的影响，为官颈癌的临床治疗提供新的理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1 细胞株人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性宫颈癌Caski细胞株，购买于中国医学科学基础研究所。

　　1.1.2主要试剂叶酸(生产厂家：扬州制药有限公司;批准文号：国药准字H20065658;原料药);RPMI-1640培养基(购于美国Hyclone公司);引物由日本TakaRa公司设计、合成;RNA提取试剂盒、SYBP⑧Premix ExTaqTM(购于日本TakaRa公司);BCA蛋白定量试剂盒(购于武汉博士德生物工程有限公司);RT-PCR试剂盒(购于南京凯基生物科技发展有限公司);兔抗人FHIT蛋白多克隆抗体(购于美国Abcam公司)等。

　　1.1.3主要仪器细胞培养瓶及培养板(购于无锡耐思生物科技有限公司);8000直热型C0：培养箱(购于美国Thermo Scientific公司);ZF-2582型全自动凝胶成像分析系统(购于上海嘉鹏科技有限公司);S251型光学倒置相差显微镜(购于日本Olym-pus公司)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞分组及处理 取对数期宫颈癌Caski细胞，调整细胞密度为1xl05个.ml-l，接种于24孔板中，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24 h。待细胞贴壁生长后，低/中/高剂量实验组分别以100、500、1 000 yg/ml叶酸处理，500 Lr,l.孔。1，对照组则以等量生理盐水处理，每孔设6个复孔，干预后继续培养48 h，于光学显微镜下观察并对比对照组及高剂量实验组宫颈癌Caski细胞形态。

　　1.2.2应用台盼蓝活细胞计数法哺1检测各组宫颈癌Caski细胞增殖情况 细胞分组及处理同前，培养48 h后收集细胞并制备细胞悬液，台盼蓝染色后进行活细胞计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色，计算各组细胞增殖抑制率=(对照组细胞数量一实验组细胞数量)/对照组细胞数量。实验重复3次。

　　1.2.3 应用RT-PCR[9]检测各组宫颈癌Caski细胞FHIT mRNA表达情况 细胞分组及处理同前，培养48 h后收集细胞，参照RNA提取试剂盒操作说明提取各组细胞RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。应用凝胶成像分析系统进行扫描、分析，以磷酸甘油醛脱氢酶基因( GAPDH)为参照，计算各组宫颈癌Caski细胞FHIT mRNA相对表达量。实验重复3次。

　　1.2.4应用Western Blotting"ol检测宫颈癌Caski细胞FHIT蛋白表达情况 细胞分组及处理同前，培养48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取50 Vg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)，然后经转膜，封闭、孵育抗体(兔抗人FHIT多克隆抗体及HRP标记的羊抗兔IgG抗体)，曝光等进行Western Blotting，以GAPDH为内参，以Q550型图像分析软件进行扫描分析，记录各组宫颈癌Caski细胞FHIT蛋白表达情况。实验重复3次。

　　1.3 统计学分析 本研究所得数据均采用SPSS19.0版统计学软件进行统计处理。计数资料以百分率(%)的形式表示，数据比较采用r检验;计量资料以(i±s)的形式表示，数据比较采用￡检验，多组间比较采用单因素方差分析。<o. p="" 05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 培养48 h后宫颈癌Caski细胞生长情况 光学显微镜下可见：对照组宫颈癌Caski细胞呈上皮型贴壁生长，细胞结构清晰，细胞质清亮，少量细胞悬浮，细胞生长状态良好;高剂量实验组官颈癌Caski细胞数量明显减少，大量细胞悬浮，细胞质中颗粒增多，细胞形态不规则。见图1。

　　图1培养48 h后宫颈癌Caski细胞形态学观察(台盼蓝染色，×100)

　　2.2各组宫颈癌Caski细胞增殖情况比较对照组及低/中/高剂量实验组活细胞数量分别为( 63. 79±1. 51)×l04个、( 54. 15±1.43)×l04个、( 42. 34±1. 12) xl04个及(32.18+0.96) xl04个;低/中/高剂量实验组宫颈癌Caski细胞增殖抑制率分别为(7.96±0.86)%、( 21. 38 +0. 91)%、(43. 51+0. 89)%。与对照组比较，低/中/高剂量实验组活细胞数量显著降低(f =19. 666，48. 406，74. 950，均P<o. p="" 05)。

　　2.3 各组宫颈癌Caski细胞FHIT表达情况比较对照组、低/中/高剂量实验组宫颈癌Caski细胞FHITmRNA相对表达量分别为(1.01±0.03)、(1.16±0. 06)、(3.92+0. 09)、(5. 83+0. 08);FHIT蛋白相对表达量分别为(1. 35±0.09)、(1.59 +0. 08)、(1.91±0. 10)、(2. 26+0. 09)。与对照组比较，低/中/高剂量实验组FHIT mRNA及FHIT蛋白相对表达量均显著升高(￡=9. 487,8.456，均P<0.05;f=103. 139，17. 660，均P<0. 05;f=239. 344, 30. 333, P<0. 05)，且均随叶酸浓度升高呈逐渐升高趋势( F=4. 055，1.874，均P<o. p="" 05)。

　　3讨论

　　国内外学者的关注。研究'll]显示：叶酸缺乏导致正常DNA合成、修复及甲基化过程受到干扰，可显著增加官颈癌发病的风险;此外，叶酸缺乏还可严重影响机体免疫监视系统，有利于恶变细胞发生免疫逃逸，但具体发病机制尚未完全阐明。王燕琴[12]研究报道：高浓度叶酸可有效抑制官颈癌SiHa细胞增殖及迁移，诱导其发生凋亡，还可有效促进宫颈癌自噬蛋白Beclin -1蛋白表达。研究[13]报道：补充叶酸可通过逆转宫颈癌C33A细胞及宫颈癌Caski细胞DN-MT1及MeCP2蛋白表达，进而抑制宫颈癌细胞增殖。本研究结果与上述报道相似，叶酸干预48 h后，高剂量实验组宫颈癌Caski细胞数量明显减少，大量细胞悬浮，细胞质中颗粒增多，细胞形态不规则，细胞增殖受到抑制，生长状态不佳;活细胞计数检测显示实验组活细胞数量较对照组显著降低，且实验组活细胞数量随叶酸浓度的升高呈逐渐降低趋势，而细胞增殖抑制率随叶酸浓度的升高呈逐渐升高趋势，提示叶酸可显著抑制宫颈癌Caski细胞增殖，且具有显著的剂量依赖性。

　　FHIT基因是位于3p14.2区域中的一种抑癌基因，F-HIT异常表达与HPV协同作用于宫颈癌的发生与进展。研究14-15报道：FHIT蛋白表达水平随宫颈癌病变程度的逐渐加重呈降低趋势。白兰、16]研究报道：FHIT基因在多种实体肿瘤中表达缺失或低表达可能是宫颈癌癌前病变发展为浸润癌的先兆，与宫颈癌患者预后密切相关。叶酸是典型的甲基供体，可通过影响FHIT基因甲基化状态，进而对FHIT mRNA及FHIT蛋白表达产生影响。本研究结果显示：与对照组比较，实验组FHIT mRNA及FHIT蛋白相对表达量均显著升高，且均随叶酸浓度升高呈升高趋势，提示叶酸对宫颈癌Caski细胞的增殖抑制作用机制可能与其显著上调FHIT表达相关，但具体作用机制仍需进一步实验验证。

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