HMGBl/TLR4在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征的关系

　   HMGBl/TLR4在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征的关系

　　柯慧慧12，段迎春3罗宁2，程忠平I 2 1.同济大学附属第十人民医院妇产科，I：海200072;2.同

　　济大学医学院妇科微创研究所，E海200090;3.上海rH浦东医院妇产科，上海201399

　　摘要：目的探讨高迁移率族蛋白Bl(HMCBI)、rrt，Jl样受体4(TLR4)信号赁白在卵巢癌组织中的表达篪异及其与临床病理特征的关系。方法 采用RT-PCR和蛋白质印迹(W'estern_hlotling)方法分别检测HM(;BI、'rIJR4、核W rKI{(Nt:-KB)及肿瘤坏死冈子d( TNF-a)存卵巢癌组织及卵巢囊肿组织中的表达情况，!结果逆转录聚合酶链应(刚1一P(m)检测娩示HM(;BJ、TLR4、_NF-KB、TNF-amRNA在卵巢囊肿及卵巢癌组织中均有表达，卵巢癌组织中表达明娩高于卵巢囊肿组，两组之间经￡检验存在显著统计学意义( P

　　关键词：高迁移率族蛋白Bl; Toll样受体4;核因子K}j;肿瘤坏死因子仪;卵巢癌

　　中国图书分类号：R737. 31文献标识码：A文章编号：1001 4411( 2018) 10-2349 -05：doi:10. 7620

　　Expression of HMGBl/TLR4 in ovarian cancer and the relationships with clinico-pathological features KE Hui-llui, DUilN Ying-Chu.n, HU Hua, et al. Department of G:ynecology arzd Obstetrics, Sh.anghai Tenth People's Hospital, Tongji Un.iver.sity, Shanghai, 200072, China

　　Abstract: Objective To e,xplore山e expression differences of' high-rru)bility group Imx l ( HMCBI ) and Toll-Iike J'ec:eptor 4 ( TI.R4)“1 0varian cam:er Lissues aiul the relationships wiLh clinicopathologicaJ features. Methods RT-PCR ancl Western l)lc)tting were usecl t le-tc(1I the expressicm levels of' HM(;BI , 'FIJR4 , NF-KB, and tumor nec:n,sis factor a ( TNr-a) in epithelial ovarian canc:er tissues and ovariancyst tissues. Results RT-PCR showed that HMGBl, TLR4, NF'-KB, ancl 'rNF_a mRNA expressed in epithelial ovarian c:anc:er tissues and c}varian cyst tissues, the expression levels of HMCBl , TLR4, NF'-KB, aricl 'rNF-a mRNA in epithelial ovarian c:ancer Li~ues were statisti- cally significantly higher than those in ovarian cyst tissues ( Pwere statislic'ally signific:anrly higher than山ose in patients with low stage c)f' cwarian canc:er. The expression Jevels I)f HMCBl , TI.H4, NF-KB, aml TN p1一仪 in patients with ovarian canc:er of'Iow and moderate differentiation were statistically signifu-antly hig~hel than th"se in I)atients with ovarian c;am:er of' n~erate aml high diflerenliation

　　Key words: HMCBI; TLR4; NF-KB; TNF-a; OvariLin cancer

　　卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌、子宫内膜癌，也是死亡率高、预后差的妇科恶性肿瘤[1-2]。卵巢癌的发病机制目前还在研究阶段，确切机制尚未完全阐明。高迁移率族蛋白Bl(HMCJBl)为高迁移率族基金项目：国家自然科学基金青年项目( 81602260)通讯作者：程忠平，E-rnail: mdcheng18@263.net蛋白超家族成员，是一种与染色体结合的非组蛋白，具有较强的致炎活性，激活受体后即可以通过刺激免疫细胞分泌炎症因子，介导和扩大炎症反应。Toll样受体( TLRs)是I型跨膜糖蛋白，是HMGB1的重要家族受体，TLR家族成员现已确认的有10个(TLR1-10)，是将固有免疫系统与获得性免疫系统连接起来的重要纽带[3]。HMGB1与TLRs结合后，激活核因子KB(NF-KB)信号通路，导致肿瘤坏死因子d中国妇幼保健2018年5月第33卷第10期Maternal and Chilcl Health Care f)f China.Mav 2018.Vol. 33，N0.1()(TNF-a)等促炎细胞因子的过度表达4l; TNF-a能刺激机体产生自由基造成机体的损伤，具有促进血管生成、促进肿瘤进展的作用。近年来研究发现炎性病理与恶性肿瘤密切相关，如人乳头瘤病毒(HPV)感染诱发宫颈癌，乙肝和丙肝可导致肝癌的发生等[5]。这些研究认为在炎症微环境中容易导致和促进肿瘤的发生、发展。吼。相关研究发现TLRs表达上调可能与参与直肠癌。肺癌[哺j、卵巢癌等p恶性肿瘤的发生、发展，但与卵巢癌的相关性尚未见报道，本研究检测HMGB1、TLR4以及下游因子NF-KB、TNF-a分别在良、恶性卵巢上皮性组织中的表达情况，探讨HMGB1、TLR4在卵巢恶性肿瘤炎症病理形成及发展中的作用。

　　1对象与方法

　　1.1 研究对象标本来自2016年度同济大学附属杨浦医院收治的因恶性卵巢肿瘤手术的20例患者，收集患者肿瘤组织。患者年龄36~63岁，平均年龄( 50. 85+7. 89)岁;临床分期I、Ⅱ期患者9例，临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者11例(采用FIGO分期标准);卵巢浆液性癌11例，卵巢子宫内膜样癌9例;低分化14例，中高分化6例。同期收集在同济大学附属杨浦医院因良性卵巢上皮性肿瘤手术的20例患者作为对照组，收集患者的卵巢囊肿囊壁，患者年龄27~70岁，平均年龄(45. 95+10. 39)岁，排除合并生殖器及其他系统的恶性肿瘤，排除患有生殖道感染、免疫、内分泌及代谢性疾病，所有患者术前均为第一次手术和未接受激素治疗。两组患者年龄比较差异均无统计学意义(均P>O. 05)。以上所有标本的收集均征得患者本人的同意并经医院伦理委员会批准。1.2标本采集 取材时间均为严格无菌条件下，收集恶性卵巢上皮性肿瘤患者肿瘤组织，良性卵巢上皮性肿瘤的囊壁组织，将标本组织即刻放人液氮罐保存，然后转运至实验室液氮保存备用。

　　1.3 方法及主要仪器、试剂1.3.1RT-PCR检测目的基因的表达将组织充分剪碎，采用Invitrogen公司提供的Trizol法提取组织总RNA，测定RNA的浓度和纯度，保证低温操作环境，然后采用Thermo公司的逆转录试剂盒制备cD-NA，PCR(RT-PCR检测仪购自美国ABI公司)扩增目的片段。采用ABI Prism 7300 SDS Software进行数据分析。

　　1.3.2蛋白质印迹( Western - blotting)检测组织中TLRs蛋白的表达将组织充分剪碎，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液匀浆(上海基尔顿生物BYLA0825)至完全裂解，4℃×12 000 r/minx15 min离心，抽提蛋白，采用BCA法定量(thermoPICPI23223)，-80℃储存备用。将蛋白样品与十二烷基磺酸钠(1×SDS)，凝胶(上海基尔顿生物BYIA0944)加样缓冲液混匀，煮沸变性5 min，蛋白按20卜Lg/孔上样，进行10% SDS-PAGE电泳(BIO-RAD mini protean3 cell)后转移至PVDF'膜，封闭，加相应稀释度的一抗( HMGBl Al)77302、TLR4Ab22048、NF - KBp65CST# 6956s、 TNF - aAb9739、GAPDH CST#5174)4℃过夜。洗涤后加二抗(碧云天HRP标记二抗：羊抗兔A0208，驴抗山羊A0181，羊抗鼠A0216)，然后予以室温封闭1 h，底物化学发光试剂( ECL)法曝光显影，采用rranc)n一5200成像系统测定条带灰度值。

　　1.4 统计学分析 使用SPSS 13.0软件统计分析，计量资料(正态分布)用(i±s)表示，用￡检验进行组内两两比较;采用相关性分析采用Pearson相关分析，r表示相关系数，r<0.3为低度正相关;0.3≤r<0.7为中度正相关;0.7≤r

　　2结果

　　2.1HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF-a mRNA在卵巢癌及卵巢囊肿组织中的表达情况 PCR结果显示HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF-a mRNA在卵巢囊肿及卵巢癌组织中均有表达，且卵巢痛组织巾表达明显高于卵巢囊肿组织(尸<0. 001)，即HMCB1、TLR4、NF-KB及TNF-amRNA在卵巢上皮性癌组织中呈高表达。见图1。

　　2.2 HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF-a在卵巢癌及卵巢囊肿组织中的表达情况 见图2。

　　Western - blotting检测结果显示HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF-a在卵巢囊肿及卵巢癌组织巾均有表达，且卵巢癌组织中表达明显高于卵巢囊肿组(P<0. 001)，即HMGB1、TLR4、NF- KB及TNF-a在卵巢上皮性癌组织中呈高表达，与实时荧光定量PCR结果相符。

　　注：图中数值表示￡值，a.P

　　图1 HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF'-a mRNA在卵巢

　　注：

　　图2巢囊肿巢癌HMGBI TI.R4 NF-KB TNF-a图中数值表示￡值，a.P

　　2.3HMGB1、rrLR4、NF-KB及TNF-a的表达与卵

　　巢上皮性癌的临床特征的关系 见图3、4。

　　I+II期

　　JⅡ+Ⅳ期

　　I+Ⅱ期

　　Ⅲ+Ⅳ期

　　HMCBlTJ一R4 NF'-KB TNF-a 注：图中数值表示z值，a.P

　　HM(;Bl TI.R4 WF-KB TNF-a

　　-4.502 -6.937

　　　　2351-

　　中一高分化

　　低分化

　　中一高分化

　　低分化

　　HMCBl TLR4 NF-xB TNF-a 注：网中数值表示f值，a.P

　　图4 HMGB1、TI.R4、NF'- KB及'l'NF—d在卵巢癌组织中的表达与病理分化的关系

　　将卵巢癌患者根据临床分期、分化程度进行分组，比较HMGB1、TLR4、NF- KB及TNF -仪mRNA蛋白表达的差异。结果显示：HMGB1、TLR4、NF-KB及TNF-a在mRNA蛋白水平上均呈现为：高分期组(Ⅲ、Ⅳ期)的表达较低分期组(I、Ⅱ期)的表达明显增加，低分化组较中高分化组的表达明显增加，差异具有统计学意义( P

　　2.4 卵巢上皮性癌组织中HMGB1、TLR4 mRNA与NF-KB及TNF-amRNA表达的相关性 将HMGB1、TLR4 mRNA与NF-KB、TNF-amRNA做相关性分析，结果显示HMGB1、TLR4 mRNA Lj NF - KB、TNF -amRNA呈高度正相关，见表1。

　　将蛋白水平HMGB1、TLR4与NF-KB、TNF-a做相关性分析，结果显示HMGB1、TLR4'5 NF-KB、TNF-d在蛋白水平上亦呈高度正相关，与RT-PCR结果相符，见表2。

　　表1卵巢癌组织中HMCB1、TI.R4、NF-KB、TNF-a mRNA表达的相关性

　　表2 卵巢痛组织中HMCB1、TT。R4、i\TF- KB、 TNF-a蛋白水平的相关性

　　3讨论

　　卵巢癌是女性生殖系统死亡率较高的恶性肿瘤，早期不易发现，中晚期治疗效果欠佳，预后差，尽管近年来卵巢癌的临床诊治方面取得了较大进展，但患者的生存率依1日比较低下。目前已知卵巢癌的危险因素有未生产、不孕、初潮早、绝经延迟、家族史，有研究发现会阴部使用滑石粉、子宫内膜异位和盆腔炎等亦会增加上皮性卵巢癌发生的风险，而妊娠、哺乳及LJ服避孕药等可降低卵巢癌的发生风险，并且发现输卵管结扎术和子宫切除术亦可能降低卵巢癌发生的风险。未生产、彳：孕、初潮早、绝经延迟与卵巢排卵增加有关，排卵过程及修复过程会产生大量的细胞因子或趋化因子，包括前列腺素、白细胞介素、肿瘤坏死I为子和各种生长因子[10]，与排卵部位相邻的卵巢表面上皮可能会持续暴露于炎症和氧化环境中，增加其恶性转变的机会。而妊娠、哺乳、口服避孕药等可降低卵巢癌的发生风险，可能与卵巢排卵次数减少有关;会阴使用滑石粉、子宫内膜异位和盆腔炎的呵能是通过由慢性感染引起的持续炎症，机体免疫系统在细胞免疫过程中产生的炎性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子均可能促进上皮性卵巢癌的发生和进展。输卵管结扎术和子宫切除术可降低卵巢癌的发生风险，可能与其阻断了经血逆流、阻隔感染炎症或污染物进入上生殖道及盆腔有一定关系。

　　近年来基于临床病理学、分子遗传学、病理研究方面的不断提高，提出了卵巢癌二元论学说和卵巢外起源学说。其中卵巢癌二元论将卵巢癌分为两种类型，即I型和Ⅱ型'3l: I型包括低级别浆液性癌、低级别子宫内膜样癌、黏液性癌、透明细胞癌移行细胞癌，生长缓慢，不具侵袭性，有前驱病变，一般经过良性一交界性一低度恶性癌的肿瘤发生模式，预后较好，多数存在K -ras和BRAF基因突变;Ⅱ型包括高级别浆液性癌、高级别子宫内膜样癌、未分化癌和恶性中胚叶混合性肿瘤等，占卵巢肿瘤的75%，其侵袭性高进展迅速，经过短暂的癌前病变即发展为癌，约80%伴有P53基因突变。以往认为卵巢癌起源于卵巢上皮性包涵体，而近年来卵巢外起源学说则认为卵巢浆液性癌来源于输卵管伞，子宫内膜样肿瘤和透明细胞瘤来自异位的子宫内膜。本课题中涉及的卵巢癌为高级别卵巢浆液性癌及卵巢子宫内膜样癌，同属于II型卵巢癌，但无论起源于输卵管j：皮或异位内膜，均已有大量研究发现卵巢癌的肿瘤环境中伴随着大量并广泛的促炎因子和趋化因子，各种细胞冈子导致的炎性环境导致细胞分裂及修复增多，增加』，DNA损伤或突变形成肿瘤的u‘能，如抑癌荩因1)53突变，终导致卵巢痈的发生。

　　HMGBl不仅为重要的致炎细胞因子，越来越多的研究发现其与肿瘤也存在密切关联，HM(：B1枉多种肿瘤细胞中呈高表达，如结肠癌、肝细胞癌、胰腺癌㈨、肾透明细胞癌㈠”及前列腺癌“”等，并且陆续有研究发现NF—KB、TNF—d等炎症因子亦‘j恶性肿瘤密切相关。已有研究证实：NF—KB抑制剂可阻断TNF一仅对宫颈癌细胞的作用，下渊NF—KB活性可抑制宫颈癌细胞增殖能刊引;HBv相关性肝病中炎症性介质NF—KB和TNF一仅的过表达参‘硼1：细胞肝癌的发生、发展22，当NF—KB/rNF—d信号通路活化受到干预后，可使癌细胞增殖发生阻滞，并促进细胞凋亡孙1。以上种种迹表明，HM(ml及TLR4介导的一系列炎症反应町’能参与肿瘤的发展。

　　本研究显示卵巢癌组织中HM(jBl、rIlLR4及其卜.游因子NF—KB、TNF一仪表达明娃高于卵巢囊肿组，HMGB1、Tl。R4高表达与临床病理特征密切相关，HHM(;B1、TLR4与NF—KB、TNF—d高度相关，这一结果提示炎性病理日J‘能涉及卵巢癌的发牛及发展，为探讨卵巢癌炎性发病机制提供理论依据，同时也为卵巢癌的防治提供指导。但本课题研究仅局限于组织水平，在以后的研究中可进一步行细胞实验、建、≯动物模型更深层次地探索卵巢癌炎症病理形成和炎性发病机制，为卵巢癌的预防和治疗提供新的思路。