去势抑郁模型大鼠海马区AQP-4的表达及意义

　　去势抑郁模型大鼠海马区AQP-4的表达及意义

　　岳鲲12，任爱华2，陈欣形2，段显亮3，杨晓光4 I.长春市吉林国健妇产医院麻醉科，吉林长春130021;2.北华大学基

　　础医学院解剖教研室，吉林吉林132013;3.北华大学附属医院骨科，吉林吉林132013;4.吉林省妇幼保健院，吉林长春130061

　　摘要：目的探讨大鼠去势合并慢性不可预见刺激后海马区AQP-4的变化，阐明AQP-4在围绝经期抑郁模型疾病的作用。方法实验大鼠随机分为假手术组、去势组、去势+CUMS 3组，观察应激前后糖摄人量及open-field抑郁模型行为学改变情况，第23天采用免疫组化及Westem Blot法检测AQP-4在大鼠海马区含量表达。结果去势组及去势+CUMS组大鼠糖摄人鲢减少，行为学表现为抑郁样表现，大鼠海马区免疫组化及Western Blot中AQP-4表达去势组较假手术组增高(P<0.05)，尤其去势+CUMS组较假手术组显著增高(P<0.01)，去势+CUMS组较去势组增高(P<0.05)。结论大鼠去势术后影响AQl，-4表达，而去势+CIJ MS联合则加霞抑郁样表现，增加AQP-4表达，AQP-4与去势抑郁模型大鼠发病密切相关，AQP-4为嗣绝经期抑郁症患者治疗及诊断提供了的新方向及靶点。

　　关键词：去势;AQP-4;抑郁症

　　中国图书分类号：R741.2文献标识码：A文章编号：100144( 2018) 10 -2341 -04;doi:1()7620/zgfyhj.j.]ssn.l001-4411. 2018. 10 57

　　围绝经期是指从卵巢功能紊乱到绝经后1年，此时期妇女由于工作生活的压力更容易罹患围绝经期抑郁症，主要表现为在围绝经期焦虑不安、情绪低落以及伴有思维迟缓和意志活动减退，存在认知功能障碍[2]。在慢性应激抑郁症动物实验中发现，雌性动物更易出现抑郁样行为，提示雌激素在抑郁症的发病中发挥重要作用。水通道蛋白家族( AQPs)是一类水通道跨膜转运蛋白家族，AQP-4在中枢神经系统主要表达在星形胶质细胞上，其作用是调节脑脊液体积及调节星形胶质细胞的功能，也有报道[3]AQP-4还参与K+缓冲。在前期实验中发现M1，抑郁症模型大鼠海马区AQP-4含量改变与抑郁症海马区神经元凋亡以及5-HT改变有关。本实验通过摘除卵巢方式模拟围绝经期大鼠并采用不可预知的长期温和应激刺激( CUMS)，探讨去势抑郁模型大鼠海马区AQP-4的改变情况。

　　1材料与方法

　　1.1 材料实验用清洁级Wistar雌性大鼠60只由吉林大学实验动物研制中心提供，体重160～180 g，采用12 h：12 h昼夜光线适应一周。随机将大鼠分为3组，假手术组、去势组、去势+CUMS组，每组各20例。AQP-4兔抗大鼠多克隆抗体、SP免疫组化试基金项目：吉林市科技创新发展计划项目医疗卫生指导计划( 201630531通讯作者：任爱华，E-mail: 396274545@ qq.com剂盒及Western Blot试剂盒(武汉博十德有限公司)，DVP- W7显微镜图像处理系统(长城信息系统公司)，Olympus生物显微镜(日本)。

　　1.2造模方法 采用水合氯醛3.0 mg/kg腹腔给药麻醉，俯卧位固定，腰椎区脊柱旁开约lc:m，切口<1 cm进入腹腔后间隙，可见卵巢，结扎输卵管，切除卵巢，假手术组切除卵巢周围脂肪组织，术后青霉素20万单位每日腹腔注射，休养1周，连续5d各组大鼠做阴道脱落细胞涂片，卵巢摘除的大鼠阴道涂片无周期性变化，由此可以证明围绝经期模型造模成功。确定造模成功后在卵巢摘除的大鼠中随机选取20只接受慢性不可预见性刺激，每天随机一种应激刺激，包括冰水游泳，热、足底电击，禁食、禁水等，持续21 d。假手术组组及去势组不接受刺激。记录第22天24 h内大鼠蔗糖摄取量引1，各组采用open—field法6]大鼠行为学评分。

　　1.3 大鼠海马区免疫组化

　　1.3. 1 大鼠脑组织固定及切片在第23天，各组取10只大鼠，根据各组大鼠体重用10%水合氯醛行腹腔内注射，在心尖部注射50 U/100 g肝素抗凝，用生理盐水和4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液先后快速灌注，开颅取脑组织后置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋。采用片厚6 ym冠状切片，贴片，56℃恒温箱干燥。进行核团部位观察和AQP-4免疫组化染色。

　　1.3.2 SP法免疫组织化学染色脱蜡、脱水，抗原修复，玻片上滴加SP试剂盒中试剂A，孵育20 min，0. 01 mol/L PBS冲洗3次。滴加试剂B，室温下孵育20 min。滴加浓度为1：50兔抗大鼠AQP-4，4℃过夜，PBS冲洗3次。滴加试剂C，室温下孵育20 min，PBS冲洗3次。滴加链霉素生物素蛋白一过氧化物酶溶液试剂D，室温孵育20 min，PBS冲洗3次。滴加DAB显色剂。脱水、二甲苯透明、封片。

　　1.3.3 AQP-4阳性细胞的计数方法 阳性神经元的形态学观察及计数，参照《大鼠脑读片纲要及图谱》(王平宇著)，显微镜下放大100倍，确定海马内AQP-4阳性神经细胞的形态及分布。免疫组化染色：染色强度以多数细胞为准，染色阴性为(一)，染色呈淡棕黄色为(+)，深棕黄色为(++)，深棕褐色为(+++)。图像分析仪处理：先在每张免疫组化染色切片上取空白区，测定背景的灰度值。随机取20个阳性细胞，用鼠标描绘所测细胞的胞膜区域，计算机自动测量灰度。减去背景值再除以20，获得该切片阳性细胞的平均灰度值。1.4 Western Blot检测大鼠海马组织中AQP-4蛋白表达

　　1.4.1 组织总蛋白质提取将各组剩余10只大鼠开颅取海马组织，剪碎，PBS冲洗，加入RIPA组织裂解液，离心机12 000 r/min离心10 min，取上清液，加入PMSF，浓度为1 mmol/I.，放入-20℃冰箱保存。

　　1.4.2 Western Blot分析 SDS-PAGE凝胶电泳：配制5%的浓缩胶，8%的分离胶，SDS上样缓冲液(pH值6. 80.1 mmol/L Tris - Cl，0.1%溴酚蓝，20%甘油，4% SDS.10%B-巯基乙醇)。取总蛋白量一致的各样品与5×SDS上样缓冲液均匀t昆合，蛋白变形采用100℃水浴5 min。冷却后，120 V电压，1.5 h电泳。半干电印迹转膜：取出凝胶，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序，由下至上进行半干转膜，转膜电流控制在50—250 mA，时间l5～50 min。封闭：取出PVDF膜，置于含5%脱脂奶粉，150 mmol/LNaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.05% Tween-20封闭液中室温2h。将封闭后的PVDF膜置入一抗溶液中，B - actin抗体(1：1 000)为内参，4℃放置过夜。取出PVDF'膜，用TTBS洗膜7 min x3次，加入二抗中1 h。TTBS洗膜7 minx3次，并显微镜图像处理系统扫描。分别分析AQP-4、p- ac tin的荧光密度值，并计算出AQP-4/[3-actin灰度比值。

　　1.5统计学分析采用SPSS 13.0统计软件及Excel表格进行统计学分析。计量资料以(x+s)表示，参数资料采用单因素方差分析，用Tukey法进行多个样本均数间两两比较<o. p="" 05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 各组大鼠行为学改变 第22天采用open -f'ield检测，去势组及去势+CUMS组大鼠出现表情呆滞、活动减少、迟缓，对外界环境淡漠，水平运动、垂直运动与假手术组相比明显减少，，去势+CUMS组减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　表1各组大鼠open-field行为学观察(i±.s)

　　2.2 各组大鼠蔗糖摄取量的改变 实验前及第22天，假手术组与去势组及去势+CUMS组相比，蔗糖摄取量明显减低，而去势+CUMS组较去势组相比也有显著降低(￡=1. 894、2.011，均<o. p="" 05)。见图1.2.3各组大鼠海马区AQP-4免疫组化染色表达 电镜下观察神经元可见假手术组大鼠海马区和齿状回中，锥体细胞层和颗粒细胞层中可见细胞排列紧密、规则，细胞核清晰可见，胞膜连续完整，未见神经元内细胞核固缩及空泡。去势组及去势+CUMS组大鼠海马区中均发现神经元细胞数量减少，排列松散、稀疏，有空泡及核固缩现象，而去势+CUMS组中海马的CA1、CA3、齿状回神经元细胞减少明显，尤以齿状回神经元减少为明显。AQP-4主要在星形胶质细胞及室管膜细胞亚群中可见，锥体细胞层和颗粒细胞有表达，呈棕黄色，而主要表现在海马区CA1、CA3、齿状回各区，尤其在血管膜周围的胶质细胞中强烈碌现，呈深棕色。去势+CUMS组及去势组较假手术组海马区齿状回表达增多，颜色为深棕色，去势+CUMS组与去势组相比，平均灰度值明显增加，与假手术组平均灰度值( 16. 18+4. 13)相比，去势组大鼠海马AQP-4平均灰度值显著增高，达( 25. 12 +4. 22)，差异有统计学意义(t=2. 14，<o. p="" 01)。海马区各组aqp-4的表达见图2～5。<="" 243，p

　　2.4 AQP-4蛋白在各组大鼠海马区表达 经West-ern blot检测，计算出AQP-4/[3-actin蛋白灰度比值，去势+CUMS组AQP-4蛋白灰度比值高，在去势组中灰度比值较假手术组中明显增高(扛2. 043，P<0. 01)，而去势+CUMS组灰度比值较假手术组增高更为明显(t=3.050.<o. p="" 05)。见图6。

　　图1 3组蔗糖摄取量

　　　　3讨论

　　调查7显示，女性抑郁症的发病率是男性的2~3倍，在围绝经期雌激素减少时期更为明显，近46%的女性患有更年期抑郁症。应用去势手术模拟围绝经期模型已被公认，去势大鼠血清中性激素水平和阴道脱落细胞变化与自然围绝经期女性的改变较为相似，为十分可靠的模拟围绝经期模型。本实验采用去势模拟围绝经期，同时予以慢性不可预见性刺激，模拟在社会及工作高强度压力下的围绝经期女性，观察行为学及海马区水通道蛋白改变。在先前的相关报道。8一中记载，OVX大鼠存在抑郁样行为增加，注射雌激素后可以减少抑郁样行为，由此证明雌激素在抑郁症的发病中起到重要作用。本实验可见去势组大鼠及去势+CUMS组大鼠糖水实验中糖水消耗均有下降，尤以去势+CUMS组下降明显。open -field实验中水平运

　　动及垂直运动减少，证明去势可以引起抑郁行为改变，而去势并慢性刺激加重抑郁样行为改变，这与先前文献报道一致9。AQP-4是广泛分布于中枢神经系统内重要水通道蛋白之一，且特异性地分布于大脑星形胶质细胞中。

　　有研究10]发现，敲除大鼠AQP-4后，大鼠体内减少雌二醇和孕酮的含量。提示AQP-4可能参与性激素对神经递质的调节，同时性激素又参与调节多种神经递质的分泌和摄取，性激素

　　除了对神经元的作用之外，发现星形胶质细胞有雌激素受体，星型胶质细胞在神经内分泌信号整合中发挥重要作用。而对去势伴慢性刺激的大鼠中海马区AQP-4的影响未见报道。本实验可见去势组及去势+CUMS组AQP-4在免疫组化及Western Blot中表达量均有增加，尤其是去势+CUMS组增高明显更为明显。前期研究04 0发现，CUMS大鼠海马区AQP-4表达增高。本实验中OVX影响AQP-4表达，而去势+CUMS联合则加重抑郁症的表现，AQP-4表达更加明显，表明AQP-4在参与抑郁样改变的同时也参与体内雌激素调节。提示围绝经期抑郁症患者不仅要考虑到雌激素影响，还与AQP-4调节息息相关，为围绝经期抑郁症患者治疗及诊断提供新方向及新靶点。

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