RhoA/ROCK信号在子宫腺肌病在位及异味内膜中的表达及其与临床特征的相关性

　　RhoA/ROCK信号在子宫腺肌病在位及异味内膜中的表达及其与临床特征的相关性

　　龚薇1,2胡花3段迎春3江彩霞2

　　1.同济大学附属第十人民医院妇产科，上海 200072;2.同济大学医学院妇产科微创医学研究所，上海 200090;3.上海市浦东医院妇产科，上海 201399

　　摘 要：目的探讨Rho GTP酶激活蛋白26( ARHGAP26)及RhoA/Rock信号蛋白在子宫腺肌病中的表达及其与临床病理特

　　征的关系。方法采用RT-PCR和Western-blotting方法分别检测ARHGAP26及RhoA、ROCK1、ROCK2信号蛋白在20例子宫腺肌

　　病患者的在位内膜( EU)、异位内膜(EC)组织以及20例增生期放置宫内节育器女性的子宫内膜组织(对照组)中的表达情况。结

　　果 RT-PCR检测显示：RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA在各组中均有表达，在EC、EU组中表达均高于对照组(P<o. p="" 01)，且ec组

　　高于EU组(P<0.01);而ARHGAP26 mRNA在EC、EU组中表达低于对照组(P<0.01)，但EC组与EU组比较，差异无统计学意义

　　(P>0.05)。蛋白质印迹检测显示：RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达在EC组、EU组中表达均高于对照组(P<o.01)，且rock1在< p="">

　　EC组中的表达高于EU组(P0.05);而ARHGAP26在

　　EC、EU组中表达均低于对照组(JP<0.01)，但EC组与EU组之间差异无统计学意义(P>0.05)。按月经量分别将EU组和EC组分

　　为月经量正常组及月经量过多组，月经量过多组RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白表达高于月经量正常组(P<o. p="" 01);而arh-

　　GAP26 mRNA表达则正好相反(P<0.01);再按痛经程度分别将EU组和EC组分为轻度、中度、重度痛经组，RhoA、ROCK1、ROCK2

　　mRNA及蛋白表达在EU组和EC组的重度痛经组中较轻、中度痛经组明显升高(P<o.ol);arhgap26表达则正好相反。结< p="">

　　论子宫腺肌病EC/EU组RhoA/ROCK mRNA及蛋白均呈高表达，ARHGAP26呈低表达，并与子宫腺肌症的临床特征相关，ARH-

　　GAP26及RhoA/ROCK在子宫内膜中的表达可能与子宫腺肌病的发病机制存在一定相关性。

　　关键词：子宫腺肌病;RhoA; ROCK l：ROCK 2;ARHGAP26

　　中国图书分类号：R711. 71文献标识码：A文章编号：1001 -44ll( 2018) 10 -2335 -07;doi:10. 7620/z~yO hj.j.issn.1001-4411. 2018.10.56

　　Expression of RhoA/ROCK signalin eutopic endometrium and ectopic endometrium

　　of patients with adenomyosis and the correlation with clinical characteristics .

　　GONG Wei, HU Hua, DUAN Ying-Chun, et al.Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Tenth People's Hospital, Tongji University, Shanghai, 200072, China

　　子宫腺肌病是育龄妇女常见的慢性疾病之一，患者的突出表现多为月经量增多及痛经程度的进行性加重，此外还有慢性盆腔痛、生育力降低等，严重影响患者健康及其生活质量。时至今日，还没有任何一种成熟的理论可以系统地解释子宫腺肌病的整个发病机制，研究引显示，其发病可能与基因表达和免疫调控、免疫炎症反应、细胞凋亡以及一些信号通路的参与等多种冈素有关。其中，RhoA/ROCK的异常激活在多种疾病(如中枢神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤等)中被发现，主要参与细胞骨架组织的迁移、分化以及平滑肌细胞收缩等生物学功能调控。Rho GTP酶激活蛋白26( ARHGAP26)是一种能够将Rho GTP酶进行水解至活性消失的一种GIP酶活化蛋白。对RhoA的蛋白因子进行调控，一旦其功能丧失就会导致RhoA表达升高和p21(细胞周期抑制因子)表达降低，导致细胞的异常增殖M1。本研究拟通过检测子宫腺肌病在位内膜(EU)及异位内膜( EC)中RhoA及其下游激酶ROCK1、ROCK2以及抑癌基因ARHGAP26的表达情况，初步对RhoA/ROCK及ARHGAP26介导的信号通路可能参与子宫腺肌病病理过程中并对其与临床症状的相关性进行探讨。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象选取2016年3月-2017年3月同济大学附属杨浦医院收治的20例子宫肌瘤手术患者为研究对象。经过术后病理检查所有患者均符合子宫肌瘤。同期选取正常放置宫内节育器的患者20例作为对照组，经知情同意后放环前取少许内膜组织。所有参与实验的患者在半年内均没有使用激素治疗的经历，无生殖道系统感染，无免疫系统及内分泌疾病，临床及病理资料完整。本研究通过医院伦理委员会核准并同意。

　　1.2组织标本采集 于子宫内膜增生期采集标本。严格无菌条件下，收集子宫腺肌病患者EU和健康女性的子宫内膜组织。收集手术中切除病灶中的EC。子宫内膜腺体和间质侵袭基层均属于EC的病理表现。将标本进行编号并送到实验室低温冷冻保存。

　　1.3 主要仪器和试剂 ARHGAP26抗体来自Abcam公司，货号Ab137085; Rockl抗体来自Abcam公司，货弓- Ab45171;Rock2抗体来自Abcam公司，货号Ab71598; RhoA抗体来自Abcam公司，货号Ab54835：羊抗兔HRP标记二抗来自碧云天，货号A0208;驴抗山羊HRP标记二抗来自碧云天，货号A0181;羊抗鼠HRP标记二抗来自碧云天，货号A0216。逆转录试剂盒及SYBRGreen PCR试剂盒购自美国Tllermo公司。

　　1.4 方法

　　1.4.1RT-PCR检测组织中目的基因的表达将之前冷冻保存的剪碎组织取出后进行匀浆处理.，将RNA提取出来并进行浓度和纯度测试，采用Trizol法进行提取。保证整个提取过程中的所有步骤为低温操作。逆转录试剂盒制备CDNA，将制备好的c:DNA进行PCR扩增。示踪物为SYBRGreen Mix，内参基因为GAPDH。扩增条件为95℃10min，40(iycle (95 0C15 s,60.C 45 s1。采用ABl Prism 7300 SDS Software进行数据分析。荧光标记引物。PCR引物详见表l。

　　表1 R'l'_PCR扩‘增t;I物

　　1.4.2 蛋白质印迹检测组织中RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26蛋白的表达 用剪刀将组织剪切成体积较小的碎片，将加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液导入，每20 mg放入150~250¨1，将其使用匀浆器进行裂解。裂解完成以后，将样品放在离心机中进行离心处理，将上清提取出来，使用I3CA法测定蛋白质含量之后冷冻保存在冰箱中。采用West-

　　ern blot检测蛋白质表达，试验方法详见文献x，，混合摇匀蛋白样品以及一倍浓度的十二烷基磺酸钠(l×SDS)凝胶，将其煮沸后进行5 min的变性处理。蛋白按20 Vg/孔上样，进行00/c SDS- PAF.电泳转移至PVDF膜，封闭，加相应稀释度的，抗4℃过夜，洗涤后加二抗，室温封闭l h，底物化学发光试剂( ECL)法曝光显影，采用Tanon -5200成像系统测定条带灰度值。

　　1.4.3 临床相关指标评定 采用月经失血图评分法( PBAC)测定患者的月经量，具体发骤为：测试者将用完卫生巾均放入塑料袋中，按照月经失m图法对失血量进行评分及填写相关表格，随后将收集到的生巾重新进行分类，并进行评分及填写表格：根据PBAC按照卫生巾的染血程度进行分级。，其巾轻度染血表示染血面积不到整个卫生巾的1/3，汁为1分;中度染血是指染血面积超过卫生巾的1/3，但不足3/5，计为5分;重度染血是指整个n牛巾都被染ff计为20分。按照排出血块的大小分为小血块、大帆块两种。小血块为1元硬币大小;超过1元硬币大小即为大血块。分别计为1分和5分。统汁卫生巾的数量，将每张卫生巾的评分、所用卫生巾的数量以及使用天数记录在评分表中。根据上述方法。6。提示有12例为月经量过多，8例为月经量正常。痛经程度根据视觉模拟评分( VAS)法评价，具体方法为：患者根据经期自身疼痛程度，在标有0—10 cm线段上描点代表疼痛程度，痛经分为4级：0分为无痛;1~3分为轻度疼痛;4—6分为中度疼痛;7 N10分为重度疼痛。将子宫腺肌病患者的痛经程度分为轻、中、重3度，结果分别为5、6、9例。

　　1.5 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学处理。定量资料正态分布数据采用(x+s)表示，采用Student's f检验或配对￡检验方法进行组内两两比较;非正态分布的数据用中位数(百分位数)表示，P<0. 05为差异有统计学意义。采用Graph Pad Prism 5绘制统计图表。

　　2结果

　　2.1 两组一般情况比较 研究组患者平均年龄( 41. 00+7. 11)岁，体质量指数(BMI)平均为(21. 60±3. 08) kg/m2。对照组平均年龄( 39. 25 +6. 92)岁，BMI平均( 20. 29+2. 67) kg/m2。两组患者组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，可以进行比较。，所选择女性的月经周期均在26—32 d之间，无异常。

　　2.2 EC、EU及子宫内膜中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA表达情况比较 RhoA、ROCK1、ROCK2 mR-NA在EC、EU组中表达均高于对照组(P<0.01)，且EC组高于EU组(P<o. 01)，但在ec组与eu组比较，差异无统计学意义(p="" mrna在ec、eu组中表达均低于对照组(p0.05)，见表2。

　　表2 3组内膜RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26mRNA表达情况(i±s，20例)

　　注：￡“、Pa为EU组t“，对照组;如、Pb为EC组∽，对照组;托、Pe为EC组m.EU。

　　2.3FC、EU及子宫内膜中RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26蛋白Western blot结果 RhoA、

　　ROCK1、ROCK2在EC组、EU组中的表达均高于对照组(P<o.01)，rock1在ec组中的表达高于eu组( p0.05)。而ARH-CAP26在EC、EU组中的表达均低于对照组(P<0. 01)，但EC组与EU组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表3。

　　2. 4 EU组、EC组中RhoA、ROCK1、ROCK2、ARHGAP26 mRNA表达与月经量、痛经程度的分析 在EU组及EC组中，按月经量分为月经量正常组及月经量过多组，RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA在月经量过多组中的表达较月经量正常组显著升高( P<o：01);而arhgap26 p="" mrna表达则反之(p<0.01)(见表4)。

　　按痛经程度分为轻、中、重度痛经组，在EU组及EC组中，RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA在重度组中的表达明显高于轻、中度组(P<0.01);ARHGAP26 mRNA表达则反之，且除EU组中AR-HGAP26 mRNA轻度与中度组组间差异无统计学意义外，其余各组表达均有差异(P<0.05)，见表5。

　　ARHCAP26

　　RHOA

　　R(X:K2

　　ROCKI

　　CAPDH

　　对照组 飘j组E(纽

　　图2 EU组、EC组、对照组内膜Rhc)A、ROCK】、 ROCK2及ARHCAP26蛋白表达情况

　　2338

　　表3 3组内膜RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26蛋白表达情况(i捣，n= 20)

　　组别 ROCKl ROCK2 RhoA ARHCAP26

　　对照组 0. 358 0+0. 140 3 0. 308 6+0. 112 8 0. 326 4+0. 987 1 0. 526 8+0.

　　EU组 0. 521 5+0. 155 1 0. 506 8+0. 163 3 0. 533 2+0. 102 2 0. 367 610.

　　EC组 0. 623 3+0. 145 1 0. 550 3+0. 216 6 0. 581 7+0. 118 9 0. 330 9+0.

　　to值 -3. 273 -4. 466 -6. 507 3. 043

　　Pa值 0.001 0.000 0.000 0.004

　　tb值 -4. 355 -4. 427 -7. 387 3. 934

　　Pb值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000

　　te值 -2.142 -0. 717 -1. 383 0. 745

　　66 9

　　64 0

　　47 6

　　Pe值 0.039 0.478 0.175 0.461

　　注：ta、Pa为EU组Ⅲ.对照组;拍、Pb为EC组vs.对照组;te、Pe为EC组v.EU组。

　　表4 月经量过多组与月经量正常组间RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26的mRNA表达况比较(i±s，n=20)

　　月经量正常组 8 0.004 1+0. 000 8 0.068 5+0. 007 2 0.072 1+0. 010 5 0.042 3+0. 006 0

　　月经量过多组 12 0. 006 4+0. 001 0 0.096 3+0. 010 1 0 128 2+0. 027 9 0.027 8+0. 004 3

　　￡值 -5. 477 -6. 714 -5. 404 6.359

　　P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000

　　表5 不同痛经组间RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26的mRNA表达情况比较(x+s，n=20)

　　注：to、Pa为轻度组z*中度组;拍、Pb为中度组w.重度组;把、Pe为轻度组vs，重度组。

　　2.5EU组、EC组中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达与月经量、痛经程度的分析 在EU组及EC组中，按月经分组，分为月经量正常组及月经量过多组，RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白在月经量过多组中的表达较月经量正常组显著升高，差异有统计学意义( P<o. p="" p<o.="" 01);且重度组椰，中度组、<="" 01);而arhgap26蛋白表达则降低明显，差异有统计学意义

　　中度组郴.轻度组蛋白表达均有明显组间差异(均P<0. 05)，ARHGAP26蛋白表达在度组中明显低于轻度组( P<o. p="" 05)，见表7。<="" 01);且除外eu中轻度”s.中度组蛋白表达差异无统计学意义外，eu及ec中其余各组的arhgap26蛋白表达均有明显差异

　　3讨论

　　子宫腺肌病为育龄期妇女一种常见的良性疾病，可导致痛经、异常子宫出血、盆腔痛等症状，而且与恶性肿瘤有一些相似的生物学行为，如种植、浸润、转移和复发等，其发生发展是一个复杂的过程。RhoA是Rho蛋白家族成员之一，它的功能发挥主要依赖GDP和GTP两者的结合，是一种小G蛋白分子，同时具有GTP酶活性。是细胞内的“分子开关”。ROCK是RhoA代表性的下游分子，以两种高度同源性的异构体形式存在( ROCKl/2)，RhoA激活后通过对下游的效应分子ROCKl/2的活化来启动下游通路，参与细胞生长及凋亡、细胞周期与细胞骨架的调控等。

　　RhoA/ROCK信号通路参与恶性肿瘤的粘附和浸润过程骷“J，异常启动的信号通路通过其复杂的相互作用使异位内膜组织异常增殖、分化，使其侵人性增强同时出现一系列炎症反应，从而促使内膜异位病灶的形成。121。研究[13]发现，RhoA在肿瘤组织中的表达高低与肿瘤的恶性程度密切相关。RhoA蛋白在卵巢癌、胃癌等组织中.的表达相较于正常组织中显著升高。由此可见，RhoA及其下游信号通路对肿瘤的发生、发展以及肿瘤的恶性程度均有一定影响。Yuge等141发现，RhoA/ROCK信号通路在异位子宫内膜的间质细胞中呈高表达。Kakinuma等[15]研究表明，RhoA通过使moesm蛋白表达和磷酸化水平升高，从而促使黏着斑、膜状突起和伪足等结构形成，终使官颈癌中细胞迁移的显著增加16。

　　ARHGAP26属于小G蛋白家族，它通过将RhoGTP酶水解为Rho GDP从而负调控RhoA蛋白，有研究17】显示，早幼粒细胞白血病的发病与ARH-GAP26的缺失和突变相关，对肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用，阻碍肿瘤细胞的合成与生长。具有抗癌的效果。斑激酶的羧基端可与ARHGAP26进行结合，Rho GTP酶会在ARHGAP26蛋白表达下调时增加活性，导致细胞的增长和繁殖变得明显。

　　子宫腺肌病有与恶性肿瘤相似的生物学行为，并与子宫内膜异位症的发病机制及组织发生学相似，而RhoA、ROCK1、ROCK2表达的改变增强子宫内膜细胞的抗凋亡能力可能是导致子宫腺肌病发病的一个重要原因，因此本研究选择RhoA、ROCK1、ROCK2及ARHGAP26作为一个研究指标，同时观察其在子宫腺肌病与正常子宫内膜中的差异。本实验提示，异位内膜中的RhoA、ROCK1、ROCK2表达非常活跃，明显高于正常的子宫内膜表达。这表明在位内膜具有较为丰富的血管生成，有利于促进内膜腺体和肌层的繁盛和生长，是子宫腺肌病发病的重要基础。同时，本研究结果提示，与月经量正常组相比，RhoA、ROCK1、ROCK2在月经量过多组中呈高表达，且RhoA、ROCK1、ROCK2在EU组及EC组中的重度痛经组中的表达较中度及轻度痛经组明显升高，因此本研究推测，RhoA/ROCK信号通路的异常启动及ARHGAP26的表达下调可能与子宫腺肌病的发病有关，并且与临床特征也存在一定的关联.

　　目前，临床上针对子宫腺肌病的治疗方案仍以切除子宫为主。本实验数据证实RhoA、ROCK1、ROCK2在子宫腺肌病患者的异位内膜和在位内膜组织中均明显升高，提示RhoA/ROCK信号通路与子宫腺肌病内膜细胞的异位种植与侵袭过程密切相关，深入研究RhoA/ROCK信号途径的作用机制，可能为更进一步明确子宫腺肌病的发病机理提供可靠依据，指导临床开拓新方法来治疗子宫腺肌病。子宫腺肌病严重危害了患者的身体和心理健康，手术具有很高的风险性，而长时间的使用激素类药物会增加患者的不良反应，一旦停药则具有很高的复发风险。因此，治疗该疾病时采用以信号通路为靶点、研发针对性药物具有良好的应用前景。