医学实验方法总结(5):分子机制—蛋白与核酸作用检测

2018.11.08 17:41
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  上一篇中给大家已经介绍了关于核酸检测的实验方法总结,这次小编给大家总结的是蛋白与核酸相互作用检测的内容。希望这次的内容能给大家带来不一样的收获。

  一、蛋白与核酸作用检测

  蛋白提取、DNA电泳迁移率实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)、RNA EMSA、RNA pull-down、生物素和脱硫生物素核酸标记

  二、凝胶迁移或电泳迁移率实验

  (一)实验概述

  凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

  (二)实验目的

  1.用于研究特定的转录因子以及转录因子所结合的顺式作用元件;

  2.用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性;

  3.评估突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响;

  4.用于研究DNA-foot printing。

  (三)实验原理

  通常将纯化的蛋白和细胞提取液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

凝胶迁移或电泳迁移率实验原理图.png

  (四)实验步骤

  使用Pierce生产的试剂盒,按照说明书操作。

  1、寡聚核苷酸的标记

  (1)冰上融化标记试剂盒所有试剂(TdT除外);

  (2)使用前,用lxTdT reaction buffer稀释TdT贮液,工作浓度为2U/μl;

  (3)按下表加入试剂(总体积50 μl):

  UltraPure water 25 μl

  5xTdT Reaction Buffer 10 μl

  Sample oligo DNA(l μl) 5 μl (final concentration 100 nM)

  Biotin-N4-CTP(5 μl) 5 μl (final concentration 0.5 μM)

  Diluted TdT(2U/μl ) 5 μl (final concentration 0.2U/μl)

  (4)37C° 30min;

  (5)加2.5μl 0.2 M EDTA终止反应;

  (6)加50 μl氯仿:异戊醇(24:1)抽提TdT,剧烈震荡,高速离心,取上层水相;

  (7)检测标记效率。

  (8)互补连退火,退火后的用于EMSA分析或-20 C°冻存。

  2、EMSA实验步骤

  (1)配制电泳胶:丙烯酰胺的浓度为4-6%,100V电压预电泳;

  (2)结合反应

  按下列顺序加试剂(总体积20 μl):

  UltraPure water dependent

  10xBinding Buffer 2 μl

  Poly(dIdC) l μl

  Unlabeled taget DNA dependent

  Protein Extract 3-5 μg

  Biotin End-labeled Tagret l μl (Final concentration 20 fM/μl)

  Antibody 4 μg

  (3)电泳

  60V电压电泳,溴酚蓝前沿至胶的2/3处停止电泳;

  (4)转膜

  380 mA电流,转膜lh;

  (5)检测

  a37 C°融化Blocking buffer和4xWashing Buffer;

  b加Blocking Bueffr,室温轻摇15 min;

  c制备Conjugate/blocking buffer solution;

  d倒出Blocking Buffer,加入Conjugate/blocking buffer solution,室温轻摇15min;

  e制备lxWashing Buffer;

  f将膜转入一干净的容器,用lxWashing Buffer洗涤4次,每次5min,室温轻摇;

  g将膜转入一干净的容器,加substrate Equilibration Buffer,室温轻摇5min;

  h制备substrate working solution(避光);

  i取出膜,在纸巾上吸去多余液体,放入干净容器,加substrate working solution,放置5min;

  j取出膜,在纸巾上吸去多余液体,用保鲜膜包好,不要有褶皱;

  k暗室中曝光,照相。

  以上的信息就是关于蛋白与核酸作用检测的实验方法之一的相关介绍,关于其他蛋白与核酸作用检测的方法详情可见附件中,大家可通过以下方式获取:

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