医学实验方法总结(1):基因操作工具

2018.11.08 10:03
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  小编给大家在医学科研的实验方法这一块做了一些整理,下面先说说基因操作工具这部分。实验方法是试验者根据科研课题的目的要求,运用一定的物质手段(科学仪器和设备),在人为控制或模拟客观条件的情况下,通过变革认知对象,获得科学事实的方法。

  一、基因操作工具总括

基因操作工具目录.png

  二、GeneA敲除载体构建(TALENs法)

  TAL效应因子(TAL effector, TALE)具有序列特异性结合能力,通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来,形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具,即TALEN。利用 TALEN 技术实现基因组定点修饰的流程包括以下几个步骤。

  第一步,从选定的目标序列中寻找合适的 TALE 候选靶位点,选择的 DNA 序列 5' 端第一个碱基最好为 T。为了能快速获得合适的 TALE 候选靶位点,目前已经建立了多个在线软件:(1) https://boglab.plp.iastate.edu;(2)http://idtale.kaust.edu.sa;(3) http://zifit.partners.org/ZiFiT ;(4)http://bloglabx.plp.iastae.edu/TALENT/help.php。

  第二步,获取针对靶序列的特TALE蛋白。这一步是 TALEN 技术最为重要和复杂的一步,目前已经有多篇文章报道了改进后的获取 TALEN 的方法 [18-22]。第三步,选择合适的 FokI结构域,利用分子生物学的方法把 TALE 和 FokI组装在一起构建完整的 TALEN 蛋白。第四步,将完整的 TALEN 引入细胞进行基因组定点修饰操作。第五步,筛选阳性克隆,评价效果。以上并不是每个 TALEN 必经的步骤,有的会在第三步与第四步之间加入酵母双杂交等评估,首先确定其活性,然后再用于实验。

  实验方法:

  根据TALEN 靶点选择的原则和文献的报道,针对 GeneA的第一外显子设计了一对靶点。先要分别构建出识别左、右半位点的 TALE重复序列载体,再与 pCS2 载体连接,形成最终的表达载体。将 TALE基本单元模块载体质粒转化至感受态细胞 TOP 菌种中;大量摇活含有质粒的大肠杆菌后,采用天根的质粒小提试剂盒提取质粒;将质粒经酶切后( SpeI、Nhe I、Hind III)进行回收、转化、连接反应,通过菌液 PCR 筛选出连接成功的质粒后,进入下一轮反应;经过几轮酶切、切胶回收及连接反应,直至完成所需要的两侧半位点的 TALE 重复序列,其中每轮的连接后都需要进行测序确认;再将 TALE 重复序列与 pCS2 载体连接,构建出最终的 pCS2-TALEN 表达载体质粒,酶切检测片段连接情况后,采用 SP6 测序确认。

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