低氧诱导因子在血管生成与宫颈癌化疗耐药性的相关研究

　　低氧诱导因子在血管生成与宫颈癌化疗耐药性的相关研究

　　夏一丹 谢兰 郑振荣

　　【摘要】目的探讨缺氧在宫颈癌血管生成拟态( VM)与化疗耐药性的相关性。方法观察宫颈癌(宫颈癌组)、宫颈上皮内瘤变(CIN组)及正常官颈组织(正常组)VM、低氧诱导因子一1仪(HIF-1仪)、血管内皮钙粘素( VE-cadherin)阳性表达情况及HIF-1 d、多耐药基因1(MDRI)、P糖蛋白(P-gp) mRNA表达量，并分析其与临床病理参数及预后的关系。结果宫颈癌组、CIN组VM、HIF-1仅阳性表达率及HIF-1 d、MDR1、P-gpmRNA表达量高于正常组(P<0.05)，官颈癌组高于CIN组(P<0.05)，VM、HIF-1仪阳性表达率与分化程度、临床分期、淋巴结转移、5年生存率有关，HIF-1 d、MDR1、P-gp mRNA表达量与肿瘤直径、分化程度、临床分期、淋巴结转移、5年生存率有关(P<0.05)。结论HIF-1 d可能通过上调VE-cadherin表达水平，参与宫颈癌组织VM形成，且可能通过上调MDR1、P-gp表达参与耐药发生。

　　【关键词】HIF-1旺;血管生成拟态;耐药;宫颈癌

　　doi:10.13 390/j .issn .1672-1861.2018 .05.010

　　缺氧是多数实体瘤的微环境之一，而血管生成拟态( vasculogemc mlnucry，VM)是多数实体瘤为适应缺氧而形成的一种功能性微循环模式，宫颈癌、前列腺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤中均存在VMⅢ。化疗耐药性是宫颈癌患者化疗失败、疾病复发的重要原因之一; Das等研究报道，缺氧可诱导肿瘤细胞对化疗产生耐受性。本研究探讨缺氧在宫颈癌VM中的作用和可能分子机制及其引起宫颈癌耐药的可能相关机制，以期为耐药性肿瘤治疗提供新的思路和治疗靶点，现报告如下。

　　资料与方法

　　一、研究对象

　　选取2010年1月至2010年12月四川省人民医院行广泛子宫切除联合术后辅助化疗的I B2期宫颈癌患者30例作为官颈癌组，预后可追踪，年龄为40 ~68岁，平均(57.16 +4.08)岁;选取因CIN行子宫全切或宫颈锥切的患者30患者作为CIN组，术后病理检查提示为CIN，年龄为42 ~71岁，平均( 59.05±5.67)岁，其中低级别上皮内瘤变( CIN l)13例，高级别上皮内瘤变(CIN 2/3)17例;选取因宫颈肌瘤或腺肌症行子宫全切者，取切除的正常宫颈组织作为对照组，且术前液基细胞学检查及术后宫颈病理检查均无异常者，年龄40 ~65岁，平均(59.13±4.82)岁。所有患者术前均未行放射治疗、化疗及物理治疗;无其他第二原发恶性肿瘤;宫颈癌术后未接受放疗治疗;病理资料完整。

　　二、检测方法

　　①HE染色：切片经脱蜡、水化、抗原修复后行苏木素溶液染色，脱水透明，置人中性树胶封片机中封片，晾干。显微镜下观察;②免疫组化染色：高温修复后，加入含5%山羊血清的封闭液，滴加鼠/兔抗人单克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体CD34和鼠抗人单克隆抗体fflF-l仅购自福州迈新生物技术有限公司，兔抗人单克隆抗体VE-cadherin购自北京博奥森公司)，再滴加二抗，DAB显色，显微镜观察色程度，流水彻底冲洗停止染色。光学显微镜下观察;③CD34-PAS双重染色法：DAB显色，显微镜下观察内皮细胞CD34着色后，流水彻底冲洗。分别滴加PAS(高碘酸一雪夫)素试剂盒ii滴(0.5%高碘酸溶液)、滴加试剂ⅡSchiff试剂1滴，组织变红时，流水冲洗1 min停止反应。光学显微镜下观察。

　　三、判断标准

　　①VM阳性表达标准：CD34的阳性颗粒表达于血管内皮细胞的浆/膜，PAS阳性表达于血管或类血管腔壁的基膜(紫红色或樱桃红色)。HE染色后CD34阴性肿瘤细胞围成的内有一层PAS阳性基膜样物质的不规则血管样结构(或可见红细胞)，排除周围出血、坏死及明显的炎性细胞后确定为VM。其中CD34、PAS均阳性表达的规则圆环形物质，作为内皮血管排除;②HIF-1 0的表达情况。HIF-1仅定位于细胞质(棕黄颗粒)。随机选5个视野(×400)，每个视野计数200个细胞。计算每张切片阳性细胞百分率，阳性细胞< 5%、5% ~490/0、≤50%、>50%分别记为0、1、2、3分，染色强度：1分：浅黄色，2分：深黄色，3分：棕黄色。染色指数为阳性细胞百分率和染色强度之和。阴性：1～2分;中度表达：3～4分;强表达：5～6分;③VE-cadherin阳性判定标准，：表达于血管内皮细胞的细胞质(弥漫性棕色颗粒)，也可见于肿瘤细胞连接处(棕褐色细线条状)。所有染色结果均由3位长期从事病理诊断的高年资医师采用盲法阅片。

　　四、预后评估

　　宫颈癌患者出院后由专门进行门诊或电话随访，随访截止为2015年1月，随访终点为随访截止日期或死亡，失访患者纳入死亡中，记录宫颈癌患者5年生存率。

　　五、统计学方法

　　采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，采用Z检验或Fisher确切概率法检验，计量资料采用xts表示，多组间比较采用F检验，两两比较采用f检验，相关性采用Pearson相关系数进行描述。P<0.05提示有统计学意义。

　　结 果

　　一、官颈癌预后分析及三组患者VM、VE-cadherin、HIF-1 0【阳性表达情况

　　宫颈癌患者30例中，随访截至末期，18例存活(60.0%)，12例死亡( 40u/o)。宫颈癌组VM阳性、VE-cadherin阳性、HIF-1 0阳性率分别为33.330/0(10/30)、46.67%(14/30)、70.000/0( 21/30)高于CIN 2/3组[11.76%( 2/17)、23.53U/o( 4/17)、47.060/0(8/17)】、CINl[7.690/o(1/13)、15.38 010( 2/13)、30.770/0( 4/13)]、及正常对照组[0(0/30)、0( 0/30)、6.670/0( 2/30)】(P<0.05),CIN 2/3组HIF-1 0【阳性率高于正常组，其余比较差异无统计学意义(P>0.05)，CIN 1组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　二、VM、HIF-1仅阳性表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系

　　VM、HIF-1仅阳性率在官颈癌患者年龄

　　(X2=0.017、0.057，P=0.897、0.811)、肿瘤直径( X2=0.019、1.607，P=0.891、0.205)上，差异无统计学意义(P>o.05)，在分化程度(X2=4.344、5.436，P=0.018、0.018)、淋巴结转移(#或Fisher确切概率法检验=4.464，P=0.035、0.019)、5年生存率上( X2=3.901、4.471，P=0.048、0.034)上，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

　　表1VM、VE-cadherin、HIF-1 0阳性表达与官颈癌患者临床病理及预后的关系[例(%)】

　　注：①P< 0.05

　　三、VM的形成分别与HIF-1仅及VE-cadherin表达的相关性

　　Pearson相关显不，VM与VE-cadherin、HIF-1仅均呈正相关关系(r=0.691\ 0.737,P< 0.05)，VE-cadherin. HIF-1仅呈正相关关系(r=0.673,P<0.05)。

　　四、三组患者HIF-la、MDRl\ P-gp mRNA表达量比较

　　宫颈癌组HIF-lamRNA. MDRl mRNA\ P-gpmRNA表达量分别为(0.61±0.13)、(0.981026)、( 0.89 +0.35)显著高于CIN 2/3组(0.28±0.12)、( 0.79±0.21)、(0.72±0.17)】、CIN 1组[(0.11±0.31)、(0.54±0.34)、(048±026)]和正常组[( 0.01 +0.01)、(0.42±O.10)、(0.31±0.21)],其余三组组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　五、HIF-la、MDRl. P-gp mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系

　　宫颈癌患者的r-nF-la、MDRl. P-gp mRNA表达量三组年龄(t:=0.667. 0.453. 0.562, P~.510.0.654. 0.578)，差异均无统计学意义(P>0.05)，其肿瘤直径(t=2.359\ 2.442. 2.125, P~0.026.0.021. 0.043)、分化程度(t=2.316. 2.223. 2.125,P=0.028\ 0.034. 0.043)、淋巴结转移(t=2.522.2.470. 2.391, P=0.018. 0.020. 0.024).5年生存率(t=2.967. 2.313. 2.562, P~0.029. 0.028. 0.016)上，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

　　表2 HIF-1仅、MDR1、P-gp mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数及及预后的关系(x±s)

　　注：①P< 0.05

　　六、HIF-la、MDRl. LRP1线性相关性分析

　　七、 Pearson相关显示，HIF-1 0l与MDRl\ P-gp均呈正相关关系(r:0.612. 0.658,P<0.05)，MDRl. P-gp呈正相关关系(r=0.702,P<0.05)。

　　讨 论

　　常氧下HIF-1 d可通过泛素一蛋白酶体途径降解，故常氧环境下HIF-1仪蛋白表达显著低于缺氧环境。HIF-1仪广泛存在于肿瘤细胞中，可通过调控超过800种靶基因如血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)、人源葡萄糖转运蛋白l(glucose transporterl，GLUT1)、GLUT3等的转录，使癌细胞适应低氧环境H。本组研究中，官颈癌组织HIF-1仅阳性率高于CIN组织和正常组织(P<0.05)，与Zagzag等研究结果一致。VM可为肿瘤生长提供营养、促进癌细胞浸润及进展，后多数实体瘤中均发现了VM。本研究中，发现官颈癌组织中存在VM。另外，宫颈癌组织中HIF-1仅、VM阳性表达情况均与分化程度、临床分期、淋巴结转移、预后有关(P<0.05)。Liu等指出，VM与肿瘤高恶性程度有关。

　　通过药物泵减少胞内的药物积聚是多数实体瘤产生耐药的重要机制之一，这个药物泵蛋白包括含有ATP结合转运蛋白家族，如MDR1、MDR1基因编码的P-gp等，其中P-gp作用类似于排出泵，可将化疗药物从癌细胞中外排，降低细胞内药物浓度。目前，MDR1基因及其编码药物流出蛋白(P-gp、乳腺癌耐药蛋白、多药耐药蛋白家族)调控耐药的机制尚未完全明确，推测为肿瘤细胞中药物流出蛋白的表达增加，伴随药物从细胞中的流出增加和MDR增加。肿瘤缺氧的微环境也是肿瘤治疗效果差及易产生放疗耐药的重要原因，HIF-1仪作为唯一一个特异性低氧状态下发挥活性的转录因子，可通过调节细胞内多种转录调控因子对缺氧做出适应性反应，维持肿瘤代谢，促使肿瘤转移，并诱导肿瘤耐药性增强。既往研究报道，Thymosin beta-4( TB4)直接导致肿瘤缺氧环境，也可通过增加HIF-1 Q的稳定性及转录活性，增加肿瘤细胞耐药隅。本研究中，官颈癌组HIF-1 0、MDR1、P-gp mRNA表达高于CIN组和正常组，与Ma等的进行动物实验研究结果相一致。在宫颈癌患者肿瘤大小、分化程度、临床分期、淋巴结转移、预后方面，HIF-1仅、MDR1、P-gpmRNA表达量也存在显著差异，说明HIF-1仅、MDR1、P-gp mRNA与宫颈癌患者临床病理密切及预后相关。以上研究发现，宫颈癌患者存在HIF-la、MDR1、P-gp共表达和过表达的现象，推测HIF-1 0可能通过调控MDR1、P-gp过表达参与官颈癌化疗耐药发生。

　　综上所述，官颈癌组织中存在VM，其与宫颈癌进展、侵袭、淋巴结转移等密切相关，HIF-1仪可能上调VE-cadherin表达水平，促进肿瘤组织中VM生成;另MDR1、P-gp在宫颈癌患者化疗耐药中扮演重要角色，两者与官颈癌病理参数密切相关，且两者均与HIF-1仅呈正相关关系，推测低氧环境下，HIF-1 d表达上升，可能诱导MDR1、P-gp表达量增加，导致化疗耐药产生。下一步研究还有待分析HIF-1 0、MDR1、P-gp的表达量与官颈癌患者预后的关系。

　　参考文献

　　[1] 高赛楠，张玉泉，苏敏，等.CGB5对卵巢癌OVCAR-3细胞血管生成拟态形成的影响[J】，肿瘤防治研究，2016, 43:733- 737.

　　[2] 高雨歌，王韩兵，张岩，等.缺氧微环境诱导胶质母细胞瘤耐药机制研究进展[J].中国肿瘤临床，2017, 44: 1100-1103.

　　[3] Das DS, Ray A, Das A, et al.A novel hypoxia-selective epigenetic agent RRx-001 triggers apoptosis and overcomes drug resistance in multiple myeloma cells[J]. Leukemia, 2016, 30: 2187-2197.

　　[4] Amelio I, Inoue S,Markert EK, et al. TAp73 0pposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor l degradation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112:226-231.

　　[5] Zagzag D, Zhong H, Scalzitti JM, et al.Expression of hypoxia- inducible factor l o【in brain tumors[J]. Cancer, 2015, 88:2606-2618.

　　[6] Liu K, Sun B, Zhao X, et al. Hypoxia induced epithelial- mesenchymal transition and vasculogenic mimicry formation by promoting Bcl-2/Twistl cooperation[J]. Exp Mol Pathol, 2015,99:383-391.

　　[7]Lee SY, Park MJ, Lee HK, et al.Increased Expression of Thy- mosin B 4Is Independently Correlated with Hypoiia Inducible Factor-l d(HIF-1 a) and Worse Clinical Outcome in Human Colorectal Cancer:[J].J Pathol Transl Med, 2016, 51:9-16.

　　[8] Ma L, Wei S, Yang B,et al.Chrysosplenetin inhibits artemisinin efflux in P-gp-over-expressing Caco-2 cells and reverses P-gp/ MDRl mRNA up-regulated expression induced by artemisinin in mouse small intestine.[J]. Pharm Biol, 2017, 55:374-380.