miR-42 79通过靶向Glil调控宫颈癌的发生发展

　　miR-42 79通过靶向Glil调控宫颈癌的发生发展

　　薛萍萍 赵燕 邹淑花

　　【摘要】目的探讨miR-4279在子宫颈癌的增殖过程中的作用及其作用靶点。方法利用qRT-PCR比较miR-4279在正常宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞系HeLa和C-33A中的表达水平;通过转染miR-4279的模拟物或抑制物的方法来过表达或敲低miR-4279;通过miR-4279靶基因预测网站miRanda和Targetscan，寻找miR-4279的靶基因;通过免疫印迹来检测Glil的蛋白水平，利用荧光素酶报告系统来检测Glil 3-UTR的活性，明确Glil是否为miR-4279的靶基因。结果①与正常官颈上皮细胞( 1.00±0.02)相比，miR-4279在宫颈癌细胞系HeLa( 0.54±0.10)和C-33A( 0.48±0.08)中表达显著较低(P<0.001);②网站预测结果显示，Glil为miR-4279的潜在靶基因;③过表达miR-4279下调Glil的蛋白水平，抑制miR-4279上调Glil的蛋白水平;④过表达miR-4279导致结合Glil的3，-UTR的能力(1.30±0.03)显著高于对照组(1.00+0.01) (P

　　【关键词】宫颈癌;微小RNA; miR-4279; Glil;抑癌因子

　　官颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。在女性常发妇科肿瘤中，其发病率仅次于乳腺癌，并且近年来发病呈现年轻化的趋势n1。微小RNA( microRNA.miRNA)是一类内源的长约19 ~22 doi:10.13 390/j .issn.1672-1861.2018 .05.004个核苷酸的单链非编码RNA，其在细胞增殖、分化、凋亡、迁移和代谢等多种生物学过程中都发挥着重要的调节作用。Glil在基底细胞癌、肺癌、胶质细胞瘤等多种肿瘤中高表达，发挥促癌因子的作用L3-5]。在官颈癌中，我们发现miR-4279能够下调癌基因Glil，提示其为潜在的抑癌靶点。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　DMEM培养基和胎牛血清购自Hyclone公司。细胞总RNA提取试剂盒购自TAKARA公司。

　　RNA反转录试剂使用GeneCopoeia公司。转染试剂Lipofectamine2000购自Thermo公司。Glil和tubulin的抗体购自Sigma公司。

　　二、实验方法

　　1.细胞培养及转染：使用含有10010胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃，5%的培养箱中培养细胞。将miR-4279的模拟物、模拟物对照、miR-4279的抑制物和抑制物对照分别瞬时转染到细胞内，转染后48 h收集细胞进行后续检验。

　　2.RNA的提取和实时荧光定量PCR( RealtimePCR)： 检测在ECTl/E6E7、HeLa和C-33A细胞中m1R-4279的表达水平。反转录引物序列为U6引 物：TGGTGTCGTGGAGTCG，miR-4279引物『: ACACTCCAGCTGGGctctcctccco U6snRNA作为内参。引物序列为U6-正向引物：5一CI℃GCITCGGCAGCACA-3;U6-正向引物：一AACGGITCACGAATITGCGT-3;m1R-4279-正向引 物：5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAITCAGTI'GAGgaagccgg-3;m1R-4279-反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT一3。 利用RocheLight Cycler 480ⅡPCR仪进行反应，PCR条件为，95℃Imin; 95℃15 s,55℃15 s,720C 30 s,40个循环。采用2-△△Ct法计算miRNA的相对表达量。 3.miR-4279模拟物和抑制物的合成：寡核苷酸均购自上海吉玛公司。序列分别为：miR-4279模拟物：正向引物5-CUCUCCUCCCGGCUUC-3：反 向 引 物5-AGCCGGGAGGAGAGUU-3;miR-4279模拟物对照： 正向引物5一UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3; 反 向 引物5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3;miR-4279抑 制 物 序 列 为：5.GAAGCCGGGAGGAGAG-3;抑制物对照序列为：5-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3。

　　4.免疫印迹法检测Glil的蛋白水平：RIPA强裂解液裂解细胞后，采用8%的SDS-PAGE胶电泳，转膜。5 010脱脂牛奶封闭后，加入一抗Glil和tubulin孵育4℃过夜。TBST洗膜，加入含辣根过氧化物酶( HRP)的二抗孵育1 h。洗去二抗后加入ECL发光液显影。

　　5.荧光素酶报告质粒的构建和报告实验：Glil的3非翻译区荧光素酶报告质粒利用如下引物扩增： 正向引物5-GCTCTAGAAGAGTAGGGAATCTCATCCATCACAGATCG-3;反向引物5-ATTTGCGGCCGCCTGATGCAGTTCCTTTATTATCAGGAAACAGTGT-3。将报告系统载体(firefly)和内参质粒( renilla)转染到96孔板中。48 h后利用Luciferase Reporter Assay Kit裂解细胞。计算firefiy和内参renilla的荧光比值。

　　三、统计学分析

　　采用SPSS10.0软件进行统计分析。数据以x+s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

　　结 果

　　一、子宫颈癌细胞HeLa和C-33A与正常宫颈上皮细胞Ectl/E6E7中miR-4279表达水平的比较 HeLa( 0.54±0.10)和C-33A中miR-4279的表达显著低于Ectl/E6E7(1.00 +0.02)，二者之间的差异有统计学意义( P<0.05)

　　二、过表达和抑制miR-4279对Glil蛋白水平的影响

　　我们利用miRNA靶基因的在线分析网站miRanda和Targetscan预测发现Glil有可能是潜在靶基因。实验表明：转染miR-4279的模拟物组Glil的蛋白水平显著低于对照组，转染miR-4279的抑制物组Glil的蛋白水平显著高于对照组，见图2。

　　图2 miR-4279对Glil蛋白水平的影响

　　讨 论

　　近年来，尽管宫颈癌的治疗手段在不断的改进和提高，但仍以手术及放疗、化疗为主。官颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒( human papillomavirus，HPV)感染密切相关，但是只有部分HPV感染者终罹患官颈癌，可见HPV并非宫颈癌发生的唯一诱因两。因此，在分子水平寻找官颈癌发生发展的其他调控因子对于宫颈癌的诊断、治疗和预后都十分重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源的长约19 ~22个核苷酸的单链非编码RNA，是真核生物基因转录后调节的重要手段口。之前的研究表明，在、骨髓瘤、乳腺癌等多种肿瘤中miRNA呈现异常表达[8-10]。miRNAs的基因治疗也成为了是肿瘤治疗的热点。通过降低致癌miRNA的表达或增强抑癌miRNA的表达均可以抑制肿瘤的生长，诱导细胞的凋亡。因此，研究miRNA在肿瘤中的异常表达具有十分重要的意义。

　　本项研究选取两种细胞系HeLa和C-33A。而HeLa为感染HPV的官颈癌细胞系，C-33A为未感染HPV的官颈癌细胞系。以两者为研究对象，能够更全面的探讨HPV及新的靶点对宫颈癌发生发展的影响。我们的研究首次发现miR-4279在宫颈癌细胞HeLa和C-33A中均异常低表达(图1)，提示其为潜在的抑癌因子。进一步的机制研究表明，miR-4279发挥作用的靶点是Glil(图2、图3)。Glil蛋白是癌基因，近几年的研究表明，通过miRNA下调Glil在肿瘤细胞中的表达，能够明显抑制肿瘤的发生发展进程，从而作为潜在的治疗靶点。如miR-324-5p能够通过抑制神经胶质瘤的增殖n 2。而在宫颈癌中的尚未发现特异性调控Glil的miRNA。我们的研究首次发现，miR-4279能够通过靶向下调癌基因Glil的表达发挥抑癌作用。

　　综上所述，本文发现官颈癌细胞系HeLa和C-33A中miR-4279表达水平低，提示其为一种潜在的抑癌因子。通过机制研究证明了癌基因Glil为其靶基因，为miR-4279抑制宫颈癌这一猜测提供了分子机制层面的佐证。我们的研究为官颈癌的精准治疗和发病机制的精细研究提供了新的靶点。未来有望通过使用miR-4279模拟物的方式抑制宫颈癌的发生发展进程。

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