HPV E6/E7 mRNA检测对于Ⅲ型转化区宫颈病变的预测价值

　　HPV E6/E7 mRNA检测对于Ⅲ型转化区宫颈病变的预测价值

　　王静 徐小敏 兰香 周燕

　　论著

　　【摘要】目的评估HPV E6/E7 mRNA检测对阴道镜下Ⅲ型转化区患者官颈病变的预测价值。方法选取2015年1月至2017年3月在浙江省衢州市人民医院妇科就诊，TCT≥ASCUS，HR-HPV阳性，阴道镜检查为宫颈Ⅲ型转化区，活检组织病理学诊断为LSIL患者52例为研究对象，行HPV E6/E7 mRNA检测及LEEP宫颈锥切，分析术前HPV E6/E7 mRNA检测与LEEP宫颈锥切后组织病理学结果相关性，并比较不同宫颈病变的HPVE6/E7 mRNA表达量。结果LEEP宫颈锥切术后总的病理升级率为46.15%( 24/52)，其中HPV E6/E7 mRNA阴性的患者总病理升级率13.33%( 2/15)，HPV E6/E7 mRNA阳性的患者总病理升级率59.46%( 22/37)，两组比较差异有统计学意义(Z=7.376，P=0.007)。病理分级与HPV E6 /E7mRNA表达量成正相关(r=0.650，P=O.OOO)。结论Ⅲ型转化区阴道镜活检组织病理学诊断为LSIL，存在漏诊宫颈高级别病变可能。术前HPV E6/E7 mRNA阳性表达对HSIL+具有较好的预测价值。

　　【关键词】HPV E6 /E7 mRNA,Ⅲ型转化区,宫颈病变

　　官颈转化区又称为移行带，为宫颈鳞、柱上皮交接部，它是原始和生理鳞.柱交界部之间的区域，是官颈癌发生的主要部位。临床上对宫颈转化区类型的判识有非常重要的意义。官颈转化区类型是影响阴道镜检查结果和活检方法的重要因素之一。经阴道镜检查为官颈Ⅲ型转化区的患者，误诊、漏诊率较高。如何筛查此类患者的宫颈病变，指导临床治疗，是目前关注热点。本研究通过对Ⅲ型转化区阴道镜活检提示低度鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)的患者进行诊断性LEEP官颈锥切，探讨术前HPV E6/E7 mRNA检测对此类患者的预测高级别官颈病变的价值。

　　资料与方法

　　一、临床资料

　　选取2015年1月至2017年3月在浙江省衢州市人民医院妇科接受诊疗的患者52例为研究对象，平均年龄(45.3±7.2)岁(32~65岁)。纳入标准：①已生育，无再生育要求;②新柏氏液基细胞学检测( thinprep cytologic test，TCT)≥不明意义的非典型鳞状细胞(atypical squamous cellof undetermined significance，ASCUS)，高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)阳性;③阴道镜宫颈为Ⅲ型转化区，且活检及搔刮组织病理学结果为LSIL。本研究得到浙江省衢州市人民医院伦理委员会批准，，并与患者告知同时签署知情同意书。

　　二、方法

　　1.TCT、HR-HPV DNA检测：采用一次性官颈采样拭子采集患者官颈脱落的细胞，并将样本保存于细胞保存液中。可通过一次取样进行TCT及Cervista HPV检测两项检查，减少了多次取样给被检者带来的不适。TCT按2001年TBS分级系统将检测结果分为正常范围( NILM)、不能明确意义的非典型鳞状细胞( ASCUS)、非典型鳞状上皮细胞不除外高度病变( ASC-H)、鳞状上皮内低度病变( LSIL)、鳞状上皮内高度病变(HSIL)、鳞状细胞癌( SCC)、不能明确意义的非典型腺细胞( AGUS)和腺癌(AC)。所有TCT涂片均由2名经验丰富的病理医师进行独立阅片和诊断。CervistaHPV检测技术所需耗材及试剂均来自Hologic公司，用于检测的细胞来自TCT检测后的同一细胞保存液。按基因亲缘关系远近将HR-HPV分为A5/A6组、A7组和A9组。A5/6组检测HPV51、56和66型;A7组检测HPV18、39、45、59和68型;A9组检测HPV16、31、33、35、52和58型。

　　2.阴道镜下官颈活检：阴道镜下对宫颈Ⅲ型转化区异常部位行多点组织活检，平均为2～4点，并行官颈管搔刮。根据子宫颈病理学和阴道镜国际联盟2002年阴道镜国际诊断标准，阴道镜下根据转化区与宫颈管外口的位置关系，分为3种类型。

　　①宫颈I型转化区：阴道镜下可见完整转化区;②宫颈Ⅱ型转化区：转化区部分可见，部分转化区位于宫颈管内，通过检查器械帮助，可见生理性鳞、柱状上皮交界。以上两者类型称为满意阴道镜检查;③宫颈Ⅲ型转化区：不可见完整转化区，为不满意阴道镜检查。病理诊断以2014年世界卫生组织( WHO)修订的妇女生殖器官肿瘤分类系统为诊断标准n1。所有标本均由2名经验丰富的病理医师进行独立阅片和诊断。

　　3.HPV E6 /E7 mRNA检测： ①取样： 同TCT、HR-HPV样本采集;②检测方法：采用QuantiVirus⑧HPV E6 /E7 mRNA定量检测试剂盒，经漂洗、裂解、缓冲、布板、信号放大、读板等步骤定量检测HPV E6 /E7 mRNA;③结果判读：拷贝数≥lcopy/ml为检测阳性。试剂盒及检测仪器均为河南新乡科蒂亚生物技术有限公司产品。

　　4.诊断性LEEP官颈锥切：患者排空膀胱后取胱结石位，常规消毒铺巾，暴露官颈，LEEP档位调至混切混凝，输出功率30～40 W.用LEEP三角电极逆时针锥形切除碘不着色区外3～5 mm，平均深度15 mm。创面电凝创面止血。切除组织标记后用10%甲醛液固定送常规病理检查。

　　三、统计学方法

　　采用SPSS 19.0统计学软件分析。计数资料比较采用Z检验，定量资料采用Mann-Whitney u检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

　　结 果

　　一、LEEP宫颈锥切术后病理诊断与术前HPVE6/E7 mRNA检测结果的关系

　　52例患者中，LEEP后组织病理学检查结果为宫颈炎的5例，LSIL 23例，HSIL 22例，宫颈癌2例，总病理升级率为46.15%( 24/52)。HPV E6/E7mRNA阴性15例， 阳性37例。HPVE6/E7 mRNA阴性的患者总病理升级率13.33010( 2/15)，HPV E6/E7 mRNA阳性的患者总病理升级率59.460/0( 22/37)，两组比较差异有统计学意义( X2=7.376.P=0.007)，见表1。

　　二、LEEP宫颈锥切术后不同病理分级与HPVE6 /E7 mRNA表达量的关联性

　　HPV E6 /E7 mRNA表达量以copies/ml表示，通过Levene方差齐性检验，F=25.985，P=O.OOO，方差不齐，故用中位数( Median)和四分位数间距( Quartile)表示其在不同级别的官颈病变中的表达量，见表2。不同病理分级HPV E6 /E7 mRNA表达量差异有统计学意义(Z= - 4.645，P=O.OOO)。Spearman相关分析显示，病理分级与HPV E6/E7mRNA表达量成正相关(r=0.650，P=O.OOO)。

　　讨 论

　　阴道镜检查是利用阴道镜的放大作用针对子宫颈被覆上皮与脉管系统进行放大检查和评估，判断是否存在宫颈病变及病变的性质、类型与范围。它是宫颈癌“三阶梯”技术的不可或缺的重要部分，在官颈病变的诊治中发挥至关重要作用[3-4]。然而影响阴道镜检查准确性的因素有很多，诸如年龄、孕产次、孕期、雌激素水平、阴道镜医师及病理科医师的经验等。其中重要的因素是宫颈转化区类型[5-6]。

　　官颈转化区是指官颈的柱状上皮被新生的鳞状上皮所取代的区域。其外缘是原始鳞状上皮与柱状上皮的交界，内缘是生理性鳞状上皮与柱状上皮的交界，是宫颈癌前病变及官颈癌发生的主要区域。因此，对官颈转化区的观察及判断，是阴道镜检查的重要内容。宫颈转化区类型是判断阴道镜检查是否满意的标志。王淼口1指出，I型转化区、Ⅱ型转化区和Ⅲ型转化区阴道镜活检和LEEP结果的符合率分别为73.4%、67.0%和55.2%，Ⅲ型转化区阴道镜活检和LEEP结果的符合率低于I型转化区、Ⅱ型转化区。何裕等哆1研究了官颈转化区类型不同对CIN诊断的影响，发现I、Ⅱ、Ⅲ转化区阴道镜下活检与LEEP术后病理符合率分别为73.43010、66.86u/0和55.94u/o，提示Ⅲ型转化区的阴道镜诊断准确性降低。究其原因可能系阴道镜检查不能对转化区进行全面观察，特别是在官颈管内无法取到活检标本。美国国家综合癌症网( NationalComprehensive Cancer Network, NCCN) 2009年官颈癌筛查指指南例提示：CIN1较少进展为高级别病变，可随访观察，但其前提为确诊无官颈高级别病变的存在。因此，有学者提出对不满意阴道镜检查为CIN 1的患者应采取LEEP治疗。但该法为有创性检查，对患者妊娠有潜在风险。那么，哪些因素会增加Ⅲ型转化区中阴道镜指示下宫颈活检为LSIL组织中漏诊HSIL+的风险呢?探讨漏诊的高危因素，是为临床决策的制定提供依据将是关注的重点所在。

　　近年致癌基因E6/E7的表达及其分子产物已成为新型生物检测标记物。有观点认为检测HPVDNA只说明病毒的存在，而E6/E7 mRNA表达、转录活性增加才具有诊断和预测价值nu。因此可通过检测E6/E7的mRNA转录水平来监视HPV致癌基因活跃转录及其对宿主细胞的影响。高危型HPV E6 /E7 mRNA检测可检测14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68) E6 /E7 mRNA，对高级别CIN的诊断及术后随访均有较高价值。Duvlis等及Ho等研究结果均表明，在诊断HSIL时HPV E6/E7 mRNA检测的特异度较好。Giorgi等”创对阴道镜检查阴性或组织学确认CIN 1的女性进行了前瞻性队列研究，发现E6/E7 mRNA表达阴性的女性发生CIN 2以上病变的风险为3.6/1000人年，仅略高于正常人;而表达阳性的女性，其风险是18.4/1 000人年，为表达阴性女性风险的5倍。刘丽等认为E6/E7 mRNA阳性表达对阴道镜检查阴性女性随访评估CIN 2+的发生具有一定的预测价值。本研究结果显示，术前HPV E6 /E7 mRNA检测阳性的妇女，宫颈高级别病变发生率为59.500/0( 22/37)，明显高于HPV E6/E7 mRNA阴性的妇女13.33c/o( 2/15)，差异有统计学意义(Z=7.376，P=0.007)。若此类患者仅行随访而不进一步确诊、处理，则存在明显医疗风险。故对于Ⅲ型转化区阴道镜活检组织病理学诊断为LSIL，而HPV E6 /E7 mRNA阳性的妇女因积极的进行干预，而对于HPV E6 /E7 mRNA阴性的妇女则可以密切随访。

　　值得注意的是，本研究中出现2例阴道镜下宫颈活检为LSIL，而LEEP术后为宫颈早浸癌的病例。2例采用国际妇产科联盟( FIGO)分期均为IA1期，均行全子宫切除。查阅文献，我们发现国内其他医院也有类似的报道。上海仁济医院的一项研究对阴道镜下宫颈活检为CIN l的304名患者行LEEP宫颈宫颈锥切术，结果术后病理有6例提示官颈浸润癌。南京医科大学的一项研究也表明：阴道镜下活检诊断CIN 1存在宫颈高级别病变及宫颈癌的漏诊。他们均认为阴道镜检查对CIN的诊断存在一定的不准确性，可导致宫颈癌的误诊，特别提出不满意的阴道镜图像(即Ⅱ、Ⅲ转化区)是其中一个重要的因素。本研究还发现，E6/E7 m RNA表达量越高，严重病变的可能性越大(P=0.650，P=O.OOO)，这与Ratnam等及王璐等的研究发现一致。其中2例LEEP术后病理为宫颈浸润癌的患者，HPV E6 /E7 mRNA表达量分别为4568.20 copies/ml及5212.50 copies/ml，均明显升高。这说明对于高表达量的患者我们要引起足够警惕。然而具体表达量的高低是否有明确的数据截点，有待于以后大样本的研究明确。 总之，Ⅲ型转化区阴道镜活检组织病理学诊断为LSIL，存在漏诊官颈高级别病变可能。HPVE6/E7 mRNA阳性表达对HSIL+具有较好的预测价值。但本文存在样本量偏小的不足，在此类患者中，是否E6/E7 mRNA阳性检测后直接行LEEP宫颈锥切更好，尚需扩大人群进行前瞻性研究。　　参考文献

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