Klotho基因G.395A多态性与慢性肾脏病的相关性分析

　　Klotho基因G.395A多态性与慢性肾脏病的相关性分析

　　李杨，羊永梅

　　[摘要] 目的探讨Klotho基因G-395A多态性与慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的关系。方法选取2017年1 -10月在中南大学湘雅医学院附属海口医院肾病风湿科治疗的CKD患者214例，按血肌酐水平将所有患者分为血肌酐水平正常组(147例)和血肌酐水平异常组(67例)，同时选取健康志愿者100例作为对照组。检测各组Klotho基因G-395A位点基因型和等位基因，并进行比较分析。结果对照组基因型GA +AA型比例、等位基因A比例分别为14. 00%和8.00%，明显高于血肌酐水平正常组、血肌酐水平异常组，差异有统计学意义(P<0.05)。血肌酐水平正常组、血肌酐水平异常组基因型GA +AA型比例与等位基因A比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。血肌酐水平正常组中，体质量指数( body mass index，BMI)< 25患者与BMI≥25患者的Klotho基因G-395A基因型和等位基因分布比较，差异无统计学意义(P>0.05);血肌酐水平异常组中，GA基因型患者胰岛素抵抗指数和尿白蛋白排泄率分别为(2.11±0.40)、(167. 28 +20. 54) mg/24 h，明显低于GG因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。非条件logistic回归分析显示G-395A位点GG +GA基因型的OR=2.004，95% CI=1. 227~3.274，提示G-395A位点的GG +GA基因型是CKD的危险因素。结论 Klotho基因G-395A位点多态性A等位基因可能是人的保护基因，而G基因型可能是CKD的致病基因。

　　[关键词] Klotho基因,多态性,慢性肾脏病

　　慢性肾脏病( chronic kidney disease，CKD)已成为全球突出的公共卫生问题，CKD在全球不同地区的发病率为100/0~15%，严重威胁人类的健康。Klotho基因是一种抗衰老基因，主要表达于肾脏[2_4]，越来越多研究表明Klotho基因在CKD的发病中占有重要作用。基因突变会导致其转录功能改变，可能引起原有代谢平衡的紊乱。Klotho基因G-395A位点位于启动子区域，而启动子作为顺式作用元件的一部分，参与调控基因的表达。本研究以214例CKD患者为研究对象，通过检测其体内的Klotho基因G-395A位点(rs1207568)，分析其多态性与慢性肾脏病发病的相关性。现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料选取2017年1-10月在中南大学湘雅医学院附属海口医院肾病风湿科治疗的CKD患者214例，按血肌酐水平将所有患者分为血肌酐水平正常组147例和血肌酐水平异常组67例，同时选取健康志愿者100例作为对照组。(1)纳入标准：CKD诊断符合2012年国际肾脏病组织“肾脏病：改善全球预后”( kidney disease: improving global out-comes，KDIGO)制定的诊断标准;患者及家属知情同意并签署同意书。(2)排除标准：合并有慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤、急慢性感染、外伤等疾病。各组受试者均为汉族，性别、年龄、体质量指数( bodymass index，BMI)等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究符合《赫尔辛基宣言》。见表1。

　　1.2试验方法使用Primer 3软件进行引物设计，根据已设计的引物序列订购引物。PCR扩增体系是25¨l。Taq PCR预混酶12.5 1_11;去离子水6.25斗l;单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms，SNP)1.25 111;基因组DNA模板5斗1。95℃预变性10 min;变性94℃10 s.62℃退火延伸40 s，循环40次;终72℃延伸10 min。采用ABI 377全自动DNA测序仪进行PCR产物的等位基因分析，直接上机读取PCR产物荧光信号，应用自动分析系统判定结果。

　　表1各组一般资料比较

　　组别 例数男/女年龄(岁，i±s) BMI(i±s)

　　注：BMI为体质量指数

　　1.3统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差(x+s)表示，多组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料以率表示，比较使用X2检验或Fisher精确检验;样本代表性采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验。以P <0. 05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 各组Klotho基因G-395A基因型和等位基因比较经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，血肌酐水平正常组、血肌酐水平异常组、对照组G-395A基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡，差异无统计学意义(P>0.05)，说明各组对象具有样本代表性。对照组的基因型GA +AA型比例、等位基因A比例明显高于血肌酐水平正常组、血肌酐水平异常组(P<0. 05);血肌酐水平正常组的基因型GA+AA型比例、等位基因A比例与血肌酐水平异常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

　　表2各组Klotho基因G-395A基因型和等位基因比较[例(%)]

　　2.2 血肌酐水平正常组不同BMI患者Klotho基因G-395A基因型和等位基因比较血肌酐水平正常组中，BMI< 25患者与BMI≥25患者的Klotho基因G-395A基因型和等位基因分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

　　表3血肌酐水平正常组不同BMI患者Klotho基因G-395A基因型和等位基因比较[例(%)]

　　注：BMI为体质量指数

　　2.3 血肌酐水平异常组不同基因型患者生化指标比较血肌酐水平异常组中，GA基因型患者胰岛素抵抗指数和尿白蛋白排泄率明显低于GG基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

　　2.4非条件logistic回归分析 以CKD作为应变量，选择G-395A位点基因型、BMI、TC、胰岛素抵抗指数、收缩压、年龄、吸烟史、饮酒史作为自变量，结果显示G-395A位点基因型、收缩压、胰岛素抵抗指数、TC是CKD的危险因素，其中GG +GA基因型的OR=2.004，95% CI为1.227~3.274。见表5。

　　表5 CKD危险因素多元回归分析结果

　　注：CKD为慢性肾脏病;TC为血清总胆同醇

　　3讨论

　　CKD威胁着人类的健康，CKD的发生与人的基因遗传、血脂、血糖的调控能力相关。Klotho基因表达水平与肾脏疾病的发生、发展密切相关，其具有肾脏保护作用。Klotho基因可通过抑制细胞凋亡，抵抗体内氧化应激及炎症反应，进而抑制高血糖对肾脏的损伤。Klotho基因可调控RAAS系统，调节内皮细胞功能，调控多种细胞因子的表达而抑制肾脏纤维化，可调节钙磷代谢，阻止血管平滑肌细胞钙化，调控离子转运以保护肾脏。在动物实验中发现，Klotho蛋白缺乏时，通过增强，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)毋1、mTOR信号通路可促进早期糖尿病肾病的发生。过表达Klotho基因通过下调早期生长反应因子1(earlygrowth response factor l,Egr-l)，抑制TGF-pl/Smad3信号通路，抑制肾小球系膜细胞外基质形成，从而减少肾脏纤维化[12]。

　　人的Klotho基因位于染色体l3ql2"3J，由5个外显子和4个内含子组成，G-395A位点位于启动子区域，参与调控基因的表达。该位点的基因型可能影响Klotho基因表达，因此本试验基于海南地区汉族人群，研究G-395A多态性位点与CKD的关联性。

　　既往研究表明，韩国人群的该位点基因频率为0. 128~0.150，肾功能正常的日本人群G-395A的等位基因A频率约0. 168[14-15]，中国四川地区90岁以上高龄老人该位点基因频率约0. 148['6J，本研究中A位点的频率为8%，与上述研究差别不大。本研究结果显示，健康对照组基因型GA +AA型比例和等位基因A比例明显高于血肌酐水平正常组、血肌酐水平异常组，差异具有统计学意义。血肌酐水平异常组组中，GA基因型患者胰岛素抵抗指数和尿白蛋白排泄率明显低于GG基因型患者。非条件logistic回归分析显示G-395A位点基因型、收缩压、胰岛素抵抗指数、TC是CKD的危险因素，其中GG +GA基因型的OR=2.004，95u/0 CI=1.227~3.274，表明CKD的发生除了与已知的胰岛素抵抗、高脂血症、高血压密切相关外，G-395A位点的GG+ GA基因型也是CKD的危险因素。A基因型可能是人的保护基因，而G基因型可能是致病基因。

　　本研究中Klotho基因G-395A多态性可能参与CKD的发生，未来可用于CKD早期诊断及治疗，而其发生机制仍需进一步研究。未来需多中心、大样表4 CKD-2组不同基因型患者生化指标比较(孑±s)

　　本量的试验进一步证实其是否可作为CKD早期筛查干预的指标，从而更好地改善CKD患者的预后。

　　[参考文献]

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