高同型半胱氨酸血症对脉搏波传导速度的影响及相关机制的研究

　　半胱氨酸血症对脉搏波传导速度的影响及相关机制的研究

　　王清传，张志敏，王元标，杨敬霄，刘 静

　　[摘要] 目的观察高同型半胱氨酸血症( hyperhomocysteinemia，HHcy)对高血压患者脉搏波传导速度(pulse wave ve-locity，PWV)的影响，以及探讨其致病相关分子机制。方法收集原发性高血压患者58例为单纯高血压组，原发性高血压伴HHcy患者52例为H型高血压组，比较2组患者PWV。使用同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)3. Ommol/L干预人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)不同时间(0—12 h)。观察细胞活力、一氧化氮(nitric oxide，NO)释放浓度、葡萄糖调节蛋白78( glucose regulated protein 78 kD，GRP78)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specificproteinase，caspase) -12表达水平。结果与单纯高血压组患者PWV(1 874.0 +196.3)相比，H型高血压组患者PWV(2 318.0±224.5)明显升高(P<0.05)。与O h组相比，Hcy 3.0 mmol/L干预HUVEC细胞6h、9h和12 h细胞活力降低，NO释放降低(P<0. 05或P<0.01)。与Oh组相比，Hcy 3.O mmol/L干预6h、12 h GRP78表达明显升高(P<0.05或P 使促凋亡因子caspase-12过表达，诱导细胞凋亡，导致细胞活力下降及NO释放减少，影响血管舒缩功能。

　　[关键词] 高同型半胱氨酸血症,高血压,脉搏波传导速度,人静脉脐细胞,内质网应激

　　[作者单位]g30000新疆维吾尔自治区乌鲁木齐，新疆军区机关医院内科(王清传、张志敏、王元标);空军军医大学唐都医院心内科(杨敬霄、刘静)

　　血中同型半胱氨酸( homocysteine，Hcy)水平高于15 ymol/L被定义为高同型半胱氨酸血症(hyper-homocysteinemia，HHcy)。基因多态性、营养因素及疾病等多种因素可干扰Hcy代谢，导致血清中Hcy水平升高。HHcy是缺血性心脏病、动脉粥样硬化及高血压病等心血管疾病的独立危险因素。副。我国人群的血清Hcy水平明显偏高，高达75%高血压患者伴有HHcy，两者协同作用使心脑血管病风险比达到11.3，远高于HHcy与其他危险因素联合作用的风险。因此，我国学者将高血压伴有血Hcy水平升高定义为H型高血压。内质网应激( endoplasmicreticulum stress，ERS)是诱导细胞凋亡的经典分子机制之一，多种因素如缺血缺氧、高糖、高脂等均可激活细胞ERS，适度ERS可使应激保护因子葡萄糖调节蛋白78( glucose regulated protein 78 kD, GRP78)表达升高，缓解细胞应激。过度的ERS则可诱导促凋亡因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( cys-teinyl aspartate specific proteinase, caspase) -12表达，促进细胞凋亡。既往研究表明，HHcy可加重高血压对左心室结构的损害，进一步降低左室功能，其机制可能与ERS过度激活有关M1。然而，HHcy协同高血压对血管功能的危害程度如何，以及相关分子机制是否与ERS相关，目前尚不清楚。脉搏波传导速度( pulse wave velocity，PWV)可反应大动脉顺应性，是对大动脉弹性功能评估的可靠指标，PWV可同时用于评估血压和动脉硬化。既往研究显示，持续血压水平升高可对动脉结构及功能造成不可逆性损害，高血压患者PWV水平明显高于血压正常人群。然而，HHcy是否能进一步影响高血压患者PWV水平，目前尚不可知。因此，本研究观察高血压协同HHcy对臂踝PWV的影响，设计细胞实验观察长期Hcy干预对内皮细胞活性及ERS相关因子GRP78及caspase-12表达的影响，旨在为H型高血压对血管的危害提供更多可靠的临床及基础依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床研究

　　1.1.1 观察对象选取2015年10月至2017年1月于新疆军区机关医院内科门诊诊断为原发性高血压患者58例为研究对象，为单纯高血压组，其中男性32例，女性26例，年龄(50 +12)岁(23~ 79岁);原发性高血压伴HHcy患者52例，为H型高血压组，其中男性31例，女性21例，年龄( 50 +12)岁(23~79岁)。人选标准：按2010年中国高血压防治指南提出的高血压诊断标准M1，经2周洗脱期和2周单盲安慰剂导人期后血压达到入选标准，收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mmHg;HHcy诊断标准：血清Hcy浓度≥15 pomol/L。排除标准：继发性高血压、糖尿病、不稳定型心绞痛、急性心脑血管事件(3个月内)、严重的肾脏及肝脏疾病、恶性肿瘤患者。所有患者均已签署知情同意书。

　　1.1.2观察指标及测定方法(1)肱踝脉搏波传导速度( baPWV)的测定：使用日本欧姆龙科林.全自动动脉硬化检测仪VP-1000( BP203 RPE-1)，患者取仰卧位，双臂及双腿伸直，掌心向上，静息5~ 10 min;将四肢血压袖带缚于上臂及下肢踝部，心音采集装置并紧贴受检者体表心尖搏动处，心电采集装置置于受检者左右腕部，每位受检者重复测量baPWV2次，取左右两侧baPWV高值进行估算。(2)血清Hcy测定：患者于清晨空腹取肘静脉血5 ml，将装有血液的离心管室温下静置10 min，置于预冷的高速心机中，4℃3 000 r/min(离心半径8c:m)离心15 min，取上清分装并冻存于- 80℃冰箱中待用。使用AP90Hcy检测试剂盒及AUSA 340Ⅱ同型半胱氨酸检测仪(深圳奥萨制药有限公司)检测血清Hcy浓度，取冻存血清及AP90Hcy检测试剂盒恢复至室温，按照同型半胱氨酸检测仪操作步骤检测血清Hcy值。

　　1.2细胞实验

　　1.2.1材料与主要试剂人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)细胞系由中国科学院细胞库提供;DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司，购自杭州四季青生物有限公司，CCK-8细胞活力检测试剂盒购自南京建成生物有限公司，兔抗大鼠GRP78及caspase-12抗体购自Ab-cam公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物科技有限公司。

　　1.2.2 HUVEC细胞系培养及分组 HUVEC细胞接种于60 mm培养皿中，加入6 ml含10% FBS高糖DMEM培养基，于37℃、5% CO，培养箱中培养。细胞生长铺满皿底80%时，给予Hcy 3.0 mmol/L分别干预0—12 h。实验重复3次。

　　1.2.3检测指标及方法 (1) HUVEC细胞活力检测：将细胞接种于96孔培养板，实验结束后，弃培养基，PBS洗3次，每孔加入100阻l不含血清的DMEM培养基，每孑L再加入 CCK8试剂，混匀后避光置于37℃、5% C07培养箱中孵育筇min，Bio-Rad酶标仪470 nm处检测吸光值。(2) NO浓度检测：使用酶联免疫吸附法测定培养基中NO浓度，试剂盒为武汉博士德生物科技有限公司提供，试剂配制及操作步骤严格按说明书进行，所有检测指标均在同次复验。(3)蛋白质印迹法(Western blot)检测GRP78及caspase-12表达：收集Hcy干预后细胞，强裂解液冰上裂解40 min，4℃12 000 r/min(离心半径8 cm)离心15 min，取上清，BCA蛋白定量后加入5×lodding buffer，100℃煮5 min。配制10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE)胶，每泳道蛋白上样量为30 p.g，电泳分离蛋白，将PAGE胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭60 min后，放人稀释(1:1 000)后的一抗中，4℃孵育过夜。Tris -Hcl缓冲液(TBST)冲洗后将膜放人碱性磷酸酶标记的二抗中，室温孵育60 min，TBST冲洗后ECL显影，image lab软件分析各条带吸光值，分析各组蛋白的相对表达水平。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(x+s)表示，使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。2组均数间比较采用单因素方差分析( One way ANOVA)，多组均数间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 高血压组与H型高血压组患者基线资料比较2组患者体质量指数、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、三酰甘油及血糖等，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

　　2.2 高血压组与H型高血压组患者心率、血压、Hcv值及PWV比较

　　与单纯高血压组相比，H型高血压组患者收缩压及舒张压略高，但差异未见统计学意义(P>0.05)。与单纯高血压组相比，H型高血压组患者血Hcy水平明显升高(P<0.05)。与单纯高血压组相比，H型高血压组患者PWV明显升高(P<0.05)。见表2。

　　2.3 Hcy对HUVEC细胞活力的影响

　　与Oh组相比，Hcy 3.0 mmol/L干预HUVEC细胞1 h及3h未明显影响HUVEC细胞活力(P>

　　0. 05)。与Oh组相比，Hcy 3.0 mmol/L干预HU-VEC细胞6h、9h及12 h HUVEC细胞活力均降低，差异有统计学意义(P <0. 05或尸<0. 01)。见图1。

　　2.4 Hcy对培养基NO浓度的影响

　　与Oh组相比，Hcy 3.0 mmol/L干预HUVEC细胞1 h升高培养基NO含量，但差异无统计学意义(P>0.05);干预HUVEC细胞6h、9h及12 h培养基NO含量降低，且差异有统计学意义(P<0.05或P<0. 01)。见图2。

　　表1 高血压组与H型高血压组患者基线资料比较(i±s)

　　注：BMI为体质量指数，TG为三酰甘油，TC为总胆固醇，HDL为高密度脂蛋白，LDL为低密度脂蛋白，GLU为葡萄糖

　　表2高血压组与H型高血压组患者心率、血压、Hcy及PWV比较(j±s)

　　注：与高血压组比较8P<0. 05.SBP为收缩压，DBP为舒张压，Hcy为同型半胱氨酸，PWV为脉博波传导速度。l mmHg=0.133 kPa

　　3讨论

　　我国高血压发病率较高，且因饮食习惯的影响， 我国人群血Hcy水平明显高于西方国家。HHcy是心血管疾病的重要危险因素，可独立预测高血压、动脉硬化及中风等疾病的发生。我国75 010的高血压患者伴有HHcy，高血压与HHcy对靶器官有协同危害作用，HHcy与高血压协同危害心脏结构及功能已被临床及基础研究证实。既往研究表明，HHcy可加重高血压对大鼠腹主动脉血管壁结构的损害，对高血压所致血管重构起促进作用‘引。然而，HHcy伴高血压对患者血管功能是否有协同危害作用，目前研究尚不清楚。本研究收集单纯高血压患者及高血压伴HHcy患者作为观察对象，检测反映动脉血管功能的PWV，PWV越快，大动脉顺应性越差，硬化度越高，用于评估血压和动脉硬化。既往研究显示，长期血压水平升高可影响动脉结构及功能，其大动脉PWV明显增高。此外，血Hcy于15~ 30 mmol/L之间为中度HHcy。研究表明，中度HHcy可对心脑血管疾病造成严重的危害。本研究观察的H压患者血Hcy水平在15~ 32 mmol/L。中度Hcy水平升高主要受饮食习惯的影响，且其是我国Hcy水平增高人群中的主要类型，而目前临床上尚未足够重视其对心脑血管的危害性。本研究为H型高血压对血管的危害作用提供了临床证据，可能对H型高血压的防治起促进作用。

　　本研究结果显示，H型高血压患者PWV水平高于单纯高血压者PWV水平，表明HHcy可加重高血压对大动脉顺应性造成的损害，进一步提示HHcy可能影响高血压患者血管壁结构，导致血管顺应性降低。因此，探讨HHcy通过何种分子机制损害血管壁结构有重要意义。既往研究表明，内皮细胞的损伤、免疫炎症反应、动脉血管平滑肌细胞增生可能是HHcy所致血管疾病发生发展的病理基础[9-11]。此次体外研究结果显示，随着Hcy干预时间的延长，HUVEC细胞的活力明显降低且NO的释放减少。这表明Hcy可直接对内皮细胞造成损害，导致NO释放减少，从而影响血管的舒张功能，提示血管内皮细胞损伤可能是HHcy损害血管壁结构、降低血管顺应性的病理基础之一。氧化应激目前被普遍认为是多种因素如缺血、高血糖、高血脂、高血压等对血管平滑肌细胞或血管内皮细胞损伤的重要分子机制12-131。然而，近年来Hcy诱导的ERS越来越引起人们的重视。在多种病理环境下，ERS与氧化应激互为因果、互相促进，调控细胞凋亡，ERS是高血压、动脉粥样硬化、心衰及缺血性心肌病等多种心血管疾病发生发展的重要分子机制14-151。缺氧、高血压、高脂和高糖等均可诱导细胞ERS，适度的ERS可使应激保护因子GRP78表达增高，增强内质网处理能力，维持细胞稳态，对细胞起保护作用，持续的ERS会导致凋亡因子caspase-12表达增高，启动凋亡通路，诱导细胞凋亡。有研究表明，Hcy可加重高血压所致的左室肥厚，其分子机制与ERS有关[16]。本研究结果显示，Hcy干预HUVEC细胞6h即可上调GRP78表达，表明Hcy激活了HUVEC细胞ERS，此时可能增强细胞对应激的处理能力，对细胞起保护作用;Hcy干预12 h后，保护蛋白GRP78表达降低，促凋亡蛋白caspase-12表达明显升高，这表明长期Hcy刺激可过度激活HUVEC细胞ERS，启动促细胞凋亡程序，使HUVEC细胞受损，细胞活力下降，NO释放减少，影响血管舒缩功能。

　　综上所述，HHcy与高血压协同损害血管顺应性，可能促进动脉硬化的发生发展，其分子机制可能是高水平Hcy导致ERS相关因子GRP78和caspase-12表达失衡，促凋亡因子caspase-12过表达，使HU-VEC细胞受损，NO释放减少，从而影响血管舒缩功能，终导致血管顺应性降低。HHcy为心血管疾病的重要危险因素，本研究将为高血压并发血管病变的防治提供新的理论依据。

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