稳心颗粒对丙烯腈所致小鼠心肌毒性的影响

　　稳心颗粒对丙烯腈所致小鼠心肌毒性的影响

　　梁鑫，楚扬，伍锋，龚 辉，吴宗贵，梁春

　　[摘要] 目的研究不同浓度丙烯腈( acrylonitrile，ACN)对小鼠的心肌毒性作用，并观察稳心颗粒对这种毒性作用的影响。方法选用50只8周龄健康雄性c57小鼠，按随机数字表法分为5组，ACN连续灌胃5d，5组ACN浓度分别为0、2、4、8、16 mg/kg，7d后通过小动物超声测量小鼠心脏左室内径和左室射血分数(LVEF)，并取心脏组织，通过末端脱氧核苷酸转移酶荧光标记( terminaldeoxynucleoitidyl transferase mediated nick and labeli”g，TUNEL)和caspase3活性检测，分析心肌凋亡情况。再选用40只8周龄健康雄性c57小鼠，按随机数字表法分为4组：(1)对照组：灌胃PBS溶液5 d;(2)稳心颗粒组：灌胃稳心颗粒0.25 mg/kg 7 d;(3)ACN组：灌胃ACN 8 mg/kg5 d;(4)ACN+稳心颗粒组：灌胃ACN 8 mg/kg 5 d后继续灌胃稳心颗粒0. 25 mg/kg 7 d。7d后测量各组小鼠心脏左室内径和LVEF，并取心脏组织，通过TUNEL和caspase3活性检测分析心肌凋亡情况。结果4、8、16 mg/kg ACN能显著增大小鼠心脏左室内径，降低LVEF，显著增加心肌凋亡，且其毒性作用ACN与浓度有相关性。与ACN组相比，ACN+稳心颗粒组左室内径显著减小，LVEF显著升高，心肌凋亡以及组织中caspase3活性显著下降。结论ACN能导致小鼠心肌毒性作用，且呈现剂量一效应关系。稳心颗粒能显著改善ACN的毒性作用.，

　　[关键词]稳心颗粒,丙烯腈,心肌毒性,小鼠

　　丙烯腈(acrylonitrile，ACN)属于高毒类有机氰化物，是石化工业中重要的化工原料及合成单体，其在许多工业生产过程中的应用越来越广泛，主要用于制造腈纶、树脂、橡胶、ABS工业塑料、聚丙烯酰胺等。ACN对长期或大剂量接触人群健康产生很大危害，同时ACN也是环境中重要的有害空气污染物之一心。近年来，随着ACN的需求和产量逐渐增加，职业接触的人群数量也在不断扩大，针对ACN的毒性研究及制定防治策略对于职业接触人群意义重大。ACN对于心血管系统的影响也有许多报道。笔者前期的研究结果显示，ACN对大鼠心肌细胞H9c2有明显毒性作用，在细胞形态、细胞活力、细胞破坏导致释放的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性、细胞坏死等方面均有显著影响，而且呈现剂量一效应关系H1。本研究首先从心脏功能和心肌凋亡的角度，探索ACN对小鼠心肌的毒性作用。

　　ACN已被体外实验证实可以代谢产生氰化物，参与急性中毒的病理过程，也可通过直接与细胞内还原型谷胱甘肽( glutathione，GSH)结合，引起体内抗氧化物质减少而导致氧化应激反应。从中医辨证的角度分析，ACN产生的氰化物，影响心肌细胞氧代谢，符合中医辨证的气虚证;后期引起心肌凋亡、心功能损伤，符合中医辨证的气滞证。稳心颗粒，主要包含党参、黄精、三七、琥珀、甘松，方中党参、黄精合用，益气养阴;三七活血化瘀，通络止痛;琥珀、甘松行气活血，镇静安神，诸药合用，共奏益气养阴，活血化瘀。可能对ACN引起的气虚气滞证具有治疗效果。本研究旨在探索稳心颗粒是否能改善ACN对心肌的毒性作用，深入的研究有助于揭示化工毒物ACN引起心血管病的毒性作用，为进一步的诊疗提供理论支持，同时为中医药治疗现代化工毒物的毒性作用提供依据。

　　1材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　实验动物选择8周龄健康雄性c57小鼠(C57BL6/J) 90只，体质量(21.5±2.O)g，购自第二军医大学实验动物中心，实验前禁食。第一部分研究：上述小鼠50只，按随机数字表法分为5组，每组10只，ACN连续灌胃Sd，5组ACN浓度分别为0、2、4、8、16 mg/kg，染毒后第7天采用小动物超声观察小鼠心脏左室内径和左室射血分数( LVEF)，并取心脏组织，通过TUNEL和caspase3活性检测，分析心肌凋亡情况。第二部分研究：上述品种小鼠40只，按随机数字表法分为4组，每组10只，分别为(1)对照组，灌胃PBS 5 d;(2)稳心颗粒组，灌胃稳心颗粒0. 25 mg/kg 7'd;(3) ACN组，灌胃ACN 8 mg/kg 5 d;(4) ACN+稳心颗粒组，灌胃ACN 8 mg/kg 5 d后继续灌胃稳心颗粒0.25 mg/kg7d。检测各组小鼠心脏左室内径和LVEF，并取心脏组织，通过TUNEL和caspase3活性检测心肌凋亡情况。

　　1.2实验仪器及试剂

　　ACN(上海石化有限公司)，caspase3活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，末端脱氧核苷酸转移酶荧光标记法( terminaldeoxynucleoitidyltransferase mediated nick and labeling, TUNEL)凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。酶标仪：美国BioTek公司，型号ELx800NB酶标仪;倒置显微镜：日本OLYMPUS公司，型号IX71-A12FL/PH，Vev0 2100小动物超声成像平台。

　　1.3检测指标及方法

　　1.3.1小鼠心脏超声小鼠异氟烷面罩吸人麻醉，随后给予心前区脱毛和清洁，四肢仰面固定于Vevo小动物超声观察台上，控制吸人气体的流量调节小鼠心跳在400次/min左右，使用小动物专用高频超声探头选取心前区典型二维切面进行图像采集，离线分析舒张期左室内径( LVIDd)、收缩期左室内径( LVIDs)、左室射血分数(LVEF)。

　　1.3.2 TUNEL染色取小鼠心脏组织，用4%多聚甲醛固定细胞30~ 60 min。PBS或HBSS洗涤2次，每次10 min。加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min。配制适当量的TUNEL检测液，TdT酶2 111+荧光标记液48配成50斗l TUNEL检测液，充分混匀。需要注意的是，配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。用PBS洗涤切片2次。在样品上加50 pul TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。PBS洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450~500 nm，发射波长范围为515~565 nm(绿色荧光)。采用Image J软件分析心肌凋亡数据。

　　1.3.3 caspase3活性检测试剂盒检测前将裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用，检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。按照每3～10 mg心肌组织入100山裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5 ml离心管中，冰浴再裂解5 min。4℃16 000—20 000 g离心10~15 min。把上清转移到冰浴预冷的离心管中。加入Ac-DEVD-pNA(2mmol/L)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60～120 min。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的对比计算出样品中催化产生的pNA量。计算出caspase3的酶活力。

　　1.4统计学处理

　　计量资料以均数±标准差(x+s)表示，使用STATA 10.0软件分析，2组均数间比较采用Wilcox-on秩和检验，多组均数间比较采用多组比较的秩和检验(Kruskal-wallis检验)。JP<0.05表示差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 各组小鼠左室内径和LVEF的变化

　　通过小动物超声测量小鼠左室内径和LVEF，结果显示，与0 mg/kg ACN组相比，4、8、16 mg/kg ACN能显著增大小鼠心脏收缩期和舒张期左室内径，降低LVEF，且与ACN浓度有相关性，见表1。

　　2.2心肌凋亡检测

　　通过TUNEL检测可见，与0 mg/kg ACN组比较，染毒各组心肌凋亡随ACN染毒浓度的上升而显著增加，见表2、图1。caspase3检测可见，心肌凋亡增加的趋势与ACN浓度相关。及合成单体，其在许多工业生产过程中有着广泛的应用。随着ACN的需求和产量逐渐增加，职业接触的人群数量也在不断扩大，针对ACN的毒性研究及制定防治策略对于职业接触人群意义重大。ACN的毒性研究从上世纪70年代开始就广泛开展，从目前的研究成果看，ACN的毒性作用一般来说包括急性中毒作用、慢性中毒作用、生殖毒性及致畸作用、致癌作用等，对神经系统、消化系统、心血管系统、血液系统、呼吸系统等均有明显损伤作用。ACN在不同物种、不同组织甚至是不同细胞类型的代谢都可能有所不同，所以其对不同系统的损伤亦各有特点。ACN自身及其代谢产物均可对机体产生不利影响，其在体内的生物转化目前已大致研究清楚，细胞色素P450 2E1( CYP2E1)是ACN体内代谢的主要途径。细胞色素P450除了绝大多数表达在肝脏细胞外，在小肠、胰腺、脑、心脏、肺、肾、骨髓、皮肤等组织中都有表达。ACN代谢主要有两条通路，即在谷胱甘肽转移酶催化下与GSH结合产生N-乙酰基-S-腈乙基-L-半胱氨酸以及在CYP2E1催化发生环氧化作用产生2一氰环氧乙烷(CEO)，此外ACN能直接与硫基蛋白发生共价结合。现已知，CN -、参与急性中毒过程，而氧化应激也是比较明确参与ACN毒性的机制之一。氧化应激是机体的活性氧等自由基与抗氧化系统的失衡，并导致组织损伤的一种状态。ACN及其代谢产物CEO作为一种肯定的GSH消耗剂，能降低机体的抗氧化能力，因而导致氧化性应激是极可能的，从而导致组织、细胞的急性损伤。此外ACN的毒性作用机制还包括代谢产物CEO的作用、细胞遗传物质DNA的损伤及细胞内钙超载等[13]。无论是在长期接触ACN人群中做的临床流行病学调查，还是动物细胞实验，都发现ACN与机体多个脏器系统病变相关。前期研究数据表明ACN对心肌细胞H9c2的细胞形态、细胞存活、细胞破坏致LDH释放、细胞凋亡等均有影响，且这种影响呈现剂量一效应关系。

　　ACN重度中毒可出现四肢阵发性强直性抽搐、昏迷，可继发呼吸、循环衰竭。《四圣心源》记载气滞证为气之虚，引起血之虚，气血不畅;心气亏虚，鼓动无力，气机不畅，故心悸胸闷，终引起循环衰竭;肺气亏虚，宣降失职，呼吸功能减弱，故咳嗽气短，终引起呼吸衰竭;津液输布无力而停聚为痰，故吐痰清稀，甚至痰堵血管;气虚全身功能减弱，劳则耗气，故声低懒言，神疲乏力，自汗，且活动后加重，甚至出现肌肉抽搐。综上所述，ACN重度中毒症状，其中医辨证极似于“气滞证”。稳心颗粒内含党参、黄精、三七、琥珀、甘松。党参、黄精合用，益气养阴;三七活血化瘀，通络止痛;琥珀、甘松行气活血，镇静安神。诸药合用，共奏益气养阴，活血化瘀。从中医辨证的角度，认为稳心颗粒可作为ACN引起心肌毒性的解毒药物。本实验的结果证实稳心颗粒可以改善ACN引起的小鼠心肌毒性，缩小左室内径，增加LVEF，改善心肌凋亡。本研究的深入开展有助于为现代工业产物引起的机体毒性提供中医辨证基础，为其临床治疗提供有效的补充。

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