通心络对豚鼠肥厚心肌电压依赖性钾通道的影响

　　通心络对豚鼠肥厚心肌电压依赖性钾通道的影响

　　黄克文，唐昱，王云霞，刘燕锋，柴育亮

　　摘要：目的 观察通心络对腹主动脉缩窄高血压豚鼠心肌肥厚的影响，探讨其抗心律失常可能的机制。方法 选择豚鼠60只.随机分为假手术组、模型组和通心络组。每组20只。假手术组只分离腹主动脉，不做结扎，灌胃8周。模型组及通心络组采用腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型成功后，分别以蒸馏水、通心络溶于蒸馏水灌胃8周。测量各组舒张末期室间隔厚度(IVSTI》、左心室舒张末期后壁厚度(I』VPWTD)，记录心肌细胞膜电容、慢激活延迟整流钾电流通道(Ik，)及快激活延迟整流钾电流通道(Ik，)电流密度。结果 与假手术组比较，模型组和通心络组IVSTD和I.VPWTD明显升高，且通心络组IVSTD及LVPWTD明显低于模型组，差异有统计学意义[(1.65±().06) mm.L(1.88±().05)mm.(1.7d±0.ll)mm u^(2. 19±o.12)mm，P pA/pF uN(3. 16±0.21)pA/pF，(10. 09±1.07) pA/pF vs (13. 76±0.19) pA/pF，P

　　关键词：主动脉，腹;高血压;心肌病。肥厚性;钾通道;肌细胞，.心脏;膜片钳术

　　持续存在的心肌肥厚不仅表现为心肌细胞肥大和间质成分的变化，还可出现心肌细胞电生理特性的改变，引起细胞膜上多种跨离子电流的异常改变，诱发恶性心律失常1 2。通心络是根据中医络病理论研制而成的，含多种虫类的中药复方制剂，具有血管、血液和心脏三重保护作用。J。有研究结果表明，通心络胶囊可以改善肥厚心肌大鼠的心功能，并减轻心肌纤维化功效，但其抗心律失常的相关研究报道不多川。本实验采用结扎腹主动脉制作心肌肥厚模型，通过全细胞膜片钳检技术检测通心络对腹主动脉缩窄性心肌肥厚豚鼠的心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的影响，旨在从分子水平为心肌肥厚心律失常的防治提供新的理论依据。

       1材料与方法

　　1.1 材料和仪器 通心络(石家庄以岭药业有限公司)，牛血清白蛋白、胶原酶(Sigma，美国);KB液：氯化钾30 mmol/l_、氯化镁0.5 mmol/I.、谷氨酸70mmoliIi、氢氧化钾10 mmol/Ii、乙二醇双(2一氨基乙基醚)四乙酸0.5 mmol/I、牛磺酸15 mmol/L、羟乙基哌嗪乙磺酸10 mmol/I.、葡萄糖10 mmol/I_、采用氢氧化钾调pH 7.3～7.4;台氏液：氯化钠127.0 mmol/L、氯化钙2.4 mmol/L、氯化钾5.9mmol/I.、葡萄糖12.0 mmol/I..氯化镁1.2 mmol/I).羟乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L，用氢氧化钠调节pH至7.4;电极外液成分(mmol/I_)：无钙台氏液;100 Umol/I.氯化钙以阻断钙离子电流;测定慢激活延迟整流钾电流通道(Ik、)时于细胞外液中再加30肛m ol/I.的三氯化镧阻断快激活延迟整流钾电流通道(Ik，)。彩色多普勒超声诊断仪(美国惠普公司)，荧光倒置显微镜(北京科乐公司)，xopatch 200B膜片钳放大器(美国Axon公司)，抛光仪MF-830(日本Narishige公司)，多导生理信号采集处理系统(RM6240型，成都仪器厂)，膜片钳仪微电极(上海奥尔科特生物科技有限公司)，玻璃电极拉制仪(华科大仪博生命科学仪器有限公司)。

　　1.2 动物与分组 选择豚鼠60只，体质量200～250 g，雌雄不限。所有豚鼠由南昌大学医学院动物中心提供。

　　实验动物随机分为假手术组、模型组及通心络组，每组20只。假手术组豚鼠只分离腹主动脉，不做结扎。模型组及通心络组豚鼠建立心肌肥厚模型成功后灌胃8周。假手术组和模型组分别以相当容量的蒸馏水灌胃，并且模型组未进行心肌肥厚治疗;通心络组将通心络溶于蒸馏水后连续灌胃，药物干预8周。

　　1.3模型制作按照参考文献方法，采取腹主动脉缩窄法制作心肌肥厚模型。豚鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，在腹左侧肋弓下缘0.5 cm、脊柱前0.5 cm处行1. 5～2.0 cm纵行切口，逐层分离出腹主动脉和肾动脉后，在肾动脉上方1cm处的腹主动脉，用8号注射针头进行结扎，结扎后退出针头。

　　1.4 室间隔厚度的测定 灌胃8周后，采用超声心动学监测各组豚鼠舒张末期室间隔厚度( interventricular septal thickness end-diastolic,IVSTD)和左心室舒张末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness end-diastolic，I。VPWTD)，其中每个心动周期重复测量5次，取平均值。

　　1.5 心肌细胞分离 按照参考文献[6]方法。腹腔注射麻醉，开胸后立即取出豚鼠心脏，去除脂肪和心包膜，固定在Langendorff灌流装置上灌流，再换用含胶原酶工和牛血清蛋白的无钙台式液灌流10min，然后用无钙台式液冲洗，去除心房和主动脉，取出心室组织，置于KB液(细胞保存液)中，剪碎心室组织，吹打，过滤，分离，静置，复钙，将心室肌细胞保存于氯化钙台氏液中备用。

　　1.6 全细胞膜片钳记录技术 保持温度25℃，吸心肌细胞悬液到浴槽中，以正常台氏液灌流。选取贴壁良好、杆状、大小适中、折光性好的心肌细胞进行封接实验。玻璃微电极由垂直拉制仪双步拉制成功。

　　采用三维液压微电极操纵器缓慢轻压细胞表面，给电极施加10～20 cm H 2()(1 cm H 2()一0.098kPa)负压，使电极尖端与细胞膜表面形成10～100GQ水平的高阻抗封接后，再以较大的负压吸破细胞膜，补偿电容电流和电机串联阻抗，形成全细胞记录，信号经AgjAgCl电极引导，由膜片钳放大器放大。在电流稳定后开始记录实验数据。由计算机通过PcIamp软件经接口盒数/模转换发放脉冲，通过模/数转换采集数据。为消除细胞间误差，将测得的膜电流除以膜电容，以电流密度表示，单位为pA/pF。膜电容是在单位电压下，从膜一侧转移到另一侧的电荷量。电流电压曲线图：以膜电压为横轴，各指令电压下的电流密度值为纵轴作图。保持电位为-30 mV，当电压去极化至+20 mV时，记录lk，电流密度;保持电位为-40 mV，当电压去极化至+80 mV，记录Ik。电流密度。

　　1.7 统计学方法 原始数据处理采用Clampfit10.O分析，采用Origin 6.0软件对测量后的数据进行拟和，计量资料以x±一表示，采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组IVSTD和LVPWTD的比较 3组IVSTD及I.VPWTD比较，差异有统计学意义(P<

　　0. Ol)。与假手术组比较，模型组和通心络组IVSTD和I.VPWTD明显升高，且通心络组IVSTD及I.VPWTD明显低于模型组，差异有统计学意义(P

　　表1 各组IVSTD和I)VPWTD的比较(mm，x±N)

　　注：与似手术组比较

　　2.2各组心肌细胞电生理改变比较假手术组，模型组与通心络组心肌细胞膜电容分别为(257. 10±13. 01) pF、(376. 11±15. 12) pF、(274. 23±11. 05)pF。3组心肌细胞膜电容比较，差异有统计学意义( P=O. 003)。与假手术组比较，模型组心肌细胞膜电容明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，通心络组心肌细胞膜电容明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3各组Ikr电流密度的比较 假手术组心肌细胞Ik，电流密度为(2. 01±0.30) pA/pF，通心络组心肌细胞I。，电流密度明显低于模型组，差异有统计学意义[(2.46±0. 21) pA/pF vs(3.16±0.21) pA/pF,P

　　2.4各组Ik。电流密度的比较假手术组心肌细胞Ik，电流密度为(7.59±1.03) pA/pF，通心络组心肌细胞lk，电流密度明显低于模型组，差异有统计学意[(10. 09±1.07) pA/pF vs (13. 76±0.19) pA/pF，研究表明，在临床上以高血压所致的心肌肥厚常见，可导致血流动力学和心功能的改变。在本研究中，采用结扎腹主动脉的方法制作高血压心肌肥厚模型，结果显示，模型组IVSTD和I。VPWTD显著增加，当给予通心络干预后，血流动力学指标明显改善，通心络组IVSTD和I。VPWTD显著降低，提示通心络可以明显改善心功能，这与相关文献报道结果一致7。

　　心肌细胞膜离子通道电流的异常改变是形成各种心律失常的重要因素，表现为心肌动作电位时程延长。肥厚心肌组织中正常和异常动作电位的心肌细胞相互毗邻，动作电位的部位差异增加可引起动作电位特性的不均一性，增加异位自律性，从而增加触发活动和恶性心律失常的发生。心肌细胞动作电位的复极相是由多种内外向电流动态平衡形成，任何离子通道电流的异常均可影响正常动作电位的形成.其中延迟整流钾离子通道构成动作电位相复极主要电流，该通道的基因突变或者受某些药物抑制后，极易诱发尖端扭转型室性心律失常，甚猝死。豚鼠心室肌中延迟整流钾离子电流包含二种成分一种是Ik，另外一种是Ik。心肌肥厚复极化的延缓町能会由于后除极、触发活动和复极化的不同产生兴奋折返而导致心律失常，增加心源性猝死的风险，本研究结果亦支持这个结论，与假手术组相比较，模型组和通心络组I。，和Ik，电流密度明显增大。

　　目前，大多数抗心律失常药物具有潜在的致心律失常作用，如索他洛尔有可能过度延长动作电位而诱发尖端扭转性室性心律失常，因此，评估一些临床抗心律失常药物的安全性，寻找安全有效的且副作用低的新型抗心律失常药物显得极为重要。通心络是依据络病学理论，由人参、全蝎、赤芍、土鳖虫、檀香，降香，乳香(制)、水蛭、蝉蜕、蜈蚣、酸枣仁(炒)及冰片1 2种中药研制而成一种复方制剂，具有益气、活血等功效。有研究结果表明，通心络可明显改善小鼠心脏功能，包括调脂、降低动脉粥样硬化，增强主动脉搏动、供血能力和血管弹性;改善内皮依赖性血管舒张功能，抑制主动脉钙化血管生成。有关通心络对电压依赖性钾通道的研究目前报道不多。在本研究中，我们观察到，与模型组比较，通心络组明显抑制心肌细胞I，和Ik。增大的电流，差异有统计学意义。动作电位延长作为肥厚心肌细胞中主要电生理改变，导致心肌细胞复极时间延长，并引起关键性的复极离散，增加恶性心律失常发生率。本研究结果表明，通心络可能通过阻断肥厚心肌细胞异常增大的电压依赖性钾离子电流，降低心肌肥厚的复极离散度，从而防止折返形成，发挥其抗心律失常功效。至于不同剂量的通心络对腹主动脉缩窄高血压豚鼠心肌肥厚电生理异常的干预作用有待进一步研究。我们相信随着对心肌肥厚电生理异常及其离子机制的深入研究，必将使我们更好地理解心肌肥厚致心律失常的发生机制，为临床预防和治疗心律失常提供新的方法和希望。

　　参考文献

　　[1] 杨跃进，赵京林，荆志成，等，中药通心络对猪急。陀心肌梗死再灌注后无再流的影响[J].中华医学杂志，2005,8.5(13):883-888.

　　[2] 李红蓉，位庚.孙颖，等，通络药物对ⅡⅡ管内皮细胞与单核细胞黏附作用的影响[J].中国循环杂志，2016,31(5):480-1183.

　　[3]刘艳妮，张莉，胡建华，等，通心络胶囊对异丙肾j：腺素诱导的心肌肥厚大鼠心功能及心肌纤维化的影响[J].中成药，2016，