常染色体显性多囊肾病家系基因特点的研究

　　常染色体显性多囊肾病家系基因特点的研究

　　刘杰，刘福颂，王芳，赵雯娜，李荣，刘宗涛，邹红梅，樊光红，张长青

　　摘要：目的 探讨一个常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidncy dise~ise，ADPKI》家系的多囊肾病基因1( polycystic kidnev disease l gene，PKDl)基因突变与遗传表型的关系。方法 对通过临床确诊为多囊肾的先证者及其家系进行基因检测，用外显子芯片捕获及高通量测序的方法，对该家系进行突变分析。通过搜索英国卡尔地夫医学遗传研究所构建的人类基因突变数据库及千人基因组计划等数据库，进行突变位点致病性的分析。进一步通过一代测序(Sanger测序法)在家系主要成员及100例正常对照者中进行验证。结果 先证者同时携带PKr)i c.4015G>A、PKDl c.98G>A 2个致病突变，PKDl c.4015G>A突变位于1 6号染色体2】61 1 53，1 5号外显子，转录本为NM_00100991J4，在ExAC东亚人数据库携带率为0.00011，该突变导致其编码的第33位氨基酸由半胱氨酸转换成酪氨酸;PKDl c.98G>A突变位于16号染色体2185593，1号外显子，转录本为NM_001009944，在F.xAC东亚人数据库携带率未知，该突变导致其编码的第1 339位氨基酸由缬氨酸转换成蛋氨酸;该位点位于突变热点，人群携带率罕见。在100例正常对照者中未发现该突变位点;而其父亲表型正常，未携带该致病突变。该家系中9人为ADPKD患者，且5人因终末期肾病在65岁之前病故。结论 PKDl c.4015G>A、

　　PKDl c.98G>A双杂合突变，该位点位于突变热点，可能是该家系ADPKD的致病突变位点。

　　关键词：多囊肾，常染色体显性;突变;遗传;基因型;高血压

　　继发性高血压是指有病因可循的高血压，约占高血压人群的10%以上。常染色体显性多囊肾病(autos.mal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是单基因遗传病，高血压是ADPKD常见的首发症状，发病率1/400～l/1000主要由多囊肾病基因1(PKDl)和多囊肾病基因2(PKD2)基因突变所致，85%由基因PKD1的突变导致，且PKD1基因突变通常比PKD2基因突变的患者病情进展要快，表现为早期发病的终末期肾病和更严重的临床表现r6-7。本研究在进行常规继发性高血压因素筛查时，发现- ADPKD家系，先证者同时携带2个新发致病突变位点PKDl c.4015G>A、PKD1c.98G>A，国内外鲜见报道，本研究通过分析本家系突变基因型与临床表型的关系，以便ADPKD临床诊治及遗传阻断。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象及临床资料收集 2017年11月入住青岛市第三人民医院的一例ADPKD患者，女性，45岁，既往高血压病史5年，具有难治性高血压合并多囊肾及尿常规异常的ADPKD临床特点，以及该家系17人中，先证者及先证者的外婆、大姨、三姨、母亲、七姨、舅舅、二表姐、三表姐共9人经多普勒超声或CT检查为多囊肾病，同时均合并高血压，发病年龄均在40～50岁(外婆已故，发病年龄不详)，且5人因多囊肾病进展为终末期肾病，分别于65岁以前病故(图1)。临床资料包括体检、多普勒超声、CT等检查。成人ADPKD超声诊断标准为：有ADPKD阳性家族史，15～39岁，双肾囊肿≥3个;40～59岁，每侧肾囊肿≥2个;年龄≥60岁每侧肾囊肿≥4个∞]。选择100例健康志愿者为正常对照者，所有研究对象已签署知情同意书，经我院医学伦理委员会批准。

　　1.2方法 采集ADPKD患者及正常对照者外周静脉血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸的抗凝管中备用，采用吸附法DNA提取试剂盒(QIAamp DNABlood Mini Kit，QIAGEN公司，德国)，提取血液样本中的DNA，经过琼脂糖电泳鉴定样本DNA质量合格后置-20 C冰箱中保存。用3.0tig DNA作为起始，根据Agilent's SureSelect XT target enrichment system的实验流程来制备文库，再用设计好的安捷伦外显子芯片对目标区域完成捕获，利用靶向外显子捕获测序技术对109个与遗传性肾病相关基因按照Illumina-SolexaHiSeq2000程序装置进行第2代测序(Next generation sequencing NGS)，测序仪器为MiSeq System(lllumina公司，美国)。运用http://+www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/b12seq程序来分析测序结果，明确突变位点，进一步通过一代测序(Sanger测序法)在家系主要成员及100例正常对照者中进行验证。

　　2 结 果

　　2.1测序结果 在人类基因组变异协会标准基础上与参考基因组NCBI Genome( http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome)比对，并综合考虑人群频率数据库Exome Aggregation Consortium( htrp：//exac. broadinstitute. org)/1000 Genomes Project和致病性数据库ClinVar( http://www. ncbi. nlm.nih. gov/clinvar) /()MIM( http: //www. omim. org)由我们的遗传咨询团队评估得出。先证者同时携带PKDl c.4015G>A.PKDl c.98G>A 2个致病突变(图2~3) ,PKDl c.4015G>A突变位于16号染色在ExA(、东业人的数据库携带率为0.00011，该突变导致其编码的第33位氨基酸由半胱氨酸转换成酪氨酸;PKDl c.98(J>A突变位于16号染色体2185593，l号外显子，转录本为NM_001009944，在ExAC东亚人数据库携带率未知，该突变导致其编码的第1339位氨基酸由缬氨酸转换成蛋氨酸。因此该位点位于突变热点，人群携带率罕见。在100例正常对照者中未发现该突变位点。

　　2.2 家系成员的临床特点 先证者同时携带PKDl c.4015G>A、PKDl c.98G>A 2个致病突变，先证者既往高血压病史5年，近1周血压升高，血压高达200/120 mm Hg(1 mm Hg=0.133kPa)，应用降压药物效果不理想，人院后检查尿常规：隐m(+十一-J，蛋白(++)，红细胞(+++)。向.常规：血红蛋白97 g/I。，肾功能、头颅及双侧肾上腺CT未见异常。腹部CT及腹部超声检查为肝内多发囊肿，双肾多发囊肿(图4～5)。

　　通过家系调查发现，家族中共有9人患多囊肾合并高血压，其中外婆、大姨、母亲、舅舅、二表姐共5人因肾功能衰竭病故，死亡年龄分别为61岁、65岁、60岁、62岁、54岁。PKI)1基因缺陷导致的多囊肾为常染色体显性遗传，单杂合性致病突变即可导致疾病的发生。

　　3讨论

　　继发性高血压是病因明确的高血压，占高血压人群比例较高，越来越受到临床的重视。ADPKD是一种继发性高血压，且高血压常为首发临床表现，甚至从年轻时开始出现血压升高，ADPKD的儿童高血压患病率也很高。早期治疗高血压町降低心血管并发症的风险，这是导致发病和死亡的主要原因。引起血压升高的原因很多，包括肾素管紧张素醛固酮系统的激活，交感神经兴奋和血管功能障碍。早期诊断和治疗高m压可以改善ADPKD的心血管和肾脏并发症。

　　ADPKD主要致病基因PKD1和PKD2他。是常染色体显性遗传，根据孟德尔遗传定律，父母任何一方患病其子女均有50%的概率因携带该基因而发病，无性别差异，约95%的患者其父亲或母亲患有ADPKD .PKD1基因定位于16号染色体短壁l区3带3亚带(16p13.3)，由46个外显子组成，编码mRNA长度为14 kb，编码4303个氨綦酸的多囊蛋白，包括N端细胞外区域、跨膜区和C端细胞内区，功能区域位于N端附近的两个富含亮氨酸的重复序列，其两端分别为富含半胱氨酸和羟基区域( flank-I_RRflank)，flank-I。RR-flank排列与蛋白质一蛋白质间联系密切相关。PKD1突变导致多囊蛋白结构变异，钙在细胞内的稳态被破坏。

　　蛋白质的功能可以以多种方式受到影响，其中常见的影响是改变蛋白质的稳定性，研究证明，ADPKD的基因突变通过导致氨基酸替代而引起致病变异，氨基酸替代可能终影响蛋白质的功能，因为蛋白质结构的改变会导致相关区域的稳定变化，因此，ARPKD发病机制可能是由于部分或完全丧失多囊蛋白功能所致。

　　本研究先证者携带复合突变PKDl c.4015(>A、PKDl c.98G≥A，突变位点位于PDK1基因功能区域N端附近，通过查找千人基因组计划、人类基因突变数据库等多个数据库，并同时参考美国医学遗传学和基因组学协会基因突变解读指南，发现该c.4015G>A、c.98(J>A突变位点位于关键的功能域，无人群携带率，与临床表型相符，可能为致病基因。该ADPKD家系中有9人患多囊肾，其中5人因肾功能衰竭病故，以早期尿毒症死亡为终末结局，临床表型较重，先证者以难以控制的高血压为首发临床表现。

　　PKD1基因缺陷导致的多囊肾为常染色体显性遗传，单杂合性致病突变即可导致疾病的发生，PKDl c.4015G>A、PKDl c.98G>A的复合基因突变可能是高致病基因，突变患者生育时有50%的概率将致病基因传给下一代并致病，因此，产前遗传学阻断有利于优生优育，防止该病在家系中蔓延。