新疆地区维吾尔族和回族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

　　新疆地区维吾尔族和回族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

　　何江，邹红云，王瑞，余伍忠 新疆军区总医院临床医学研究所，新疆乌鲁木齐8300002295

　　摘要：目的 了解新疆地区维吾尔族和回族苯丙酮尿症( PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变特征，为该地区PKU的产前诊断和遗传咨询提供理论依据。方法应用PCR产物直接测序法、基因芯片捕获和二代高通量测序技术共对47例维吾尔族和回族PKU患儿及其父母的PAH基因启动子、第1~13外显子及其旁侧内含子等区域进行PAH基因突变分析。结果在新疆地区维吾尔族(33例)、回族(14例)PKU患者PAH等位基因中分别检测出27种、19种不同的突变基因，总检测率分别为89.4% (59/66)、89. 3% (25/28)，均以错义突变(51. 9a/o、68.4%)、剪接位点突变和无义突变为主，两民族PAH基因大部分致病突变主要分布在第6、7、12外显子。维吾尔族PKU患者PAH基因常见的致病突变是R413P( 12. 1010)、R243Q (9. 1%)、EX6-96A>G (7. 6c/0)、F161S (7. 6%)、IVS10-11G>A (6. 1%)、P281L (4. 5%)和IVS11 -2A>C(4.5%);而回族常见的致病突变是R413P、R243Q、R155H、R176X、R241C和A300S(均为7.1%)，新疆维吾尔族PKU患者常见的PAH基因致病突变是R413P，不同于中国汉族和韩国常见突变是R243Q，也不同于欧洲常见突变是R408W。IVS11-2A>C和R155H可能分别是新疆维吾尔族、回族独有的PAH突变类型，新疆维吾尔族、回族PAH基因突变与中国北方类似，但显著区别于欧洲、拉丁美洲及中亚等国家及地区。新疆地区回族PKU患者中检出的MlI(c.3G>T)是国际上未见报道的新的PAH基因突变，而T81N(c.242C>A)、V230A(c.689T>C)和L348V(c.1042C>G)突变为国内首次报道。结论新疆地区维吾尔族和回族的PAH突变基因具有其自身独立保守的特性，而且还存在相互交叉、相互融合的特征，提示新疆多民族地区是研究基因突变多样性、PAH异质性以及人类起源、迁徙等的遗传资源宝库。

　　关键词：苯丙酮尿症;苯丙氨酸羟化酶;基因突变;维吾尔族;回族

　　苯丙酮尿症( PKU)是一种常染色体隐性遗传病，发病的分子基础是苯丙氨酸羟化酶( PAH)基因的异常突变，这类突变包括所有外显子以及内含子、5 7一UTR和3，-UTR等区域，突变形式也涵盖错义突变、小缺失、剪切位点突变、沉默突变、无义突变、小插入及大片段插入等[1-2]。世界范围内报道的PAH基因突变已达996种(截至2017年6月29日)，这为全面阐述PKU发病的分子机制奠定了坚实基础。新疆地区作为古今“丝绸之路”上的重要区域，伴随几千年来的经贸往来、文化交流和民族间通婚，也造就本地区不同民族间遗传基因的彼此交叉和融合，对本地区的遗传流行病学和人类迁徙学产生了广泛的影响。现对新疆地区确诊的47例维吾尔族和回族PKU患儿及其父母进行PAH基因突变分析，以探究新疆地区不同民族PAH基因的突变规律及特点，现报道如下。

　　1对象与方法

　　1.1 研究对象 收集2003年1月- 2016年12月在新疆军区总医院新生儿疾病筛查及儿科门诊就诊并终确诊的47例PKU患儿为研究对象，其中男24例，女23例;维吾尔族33例，回族14例，年龄2个月~ 14岁，平均年龄(2.8±0.9)岁。初诊血清苯丙氨酸( Phe)浓度272～2 153 ymol/I.(正常参考值<120Lmol/L)。确诊标准及流程参照文献。所有受试患儿及家长均签署知情同意书，研究经过本院伦理委员会审查批准实施。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集及DNA提取抽取患儿及父母外周静脉血4 mJ，先在滤纸上滴3—5个直径12 mm滤纸斑，阴凉干燥避光处晾干，1～2 h后装入无菌干净密封袋内备用，剩余全血置4℃冰箱备用。血斑采用快速酚/氯仿抽提法，全血采用QIAamp DNA Blood MidiKit提取法，提取的基因组DNA保存于-20℃备用。

　　1.2.2 PCR扩增及序列测定 24例标本采用PCR产物直接测序方法进行PAH基因突变检测。PAH基因启动子及第1~ 13外显子的引物序列参照文献31设计合成，PCR扩增及Sanger测序具体操作方法参照文献。

　　1.2.3应用基因芯片捕获和二代高通量测序技术检测PAH基因突变 23例全血样本采用QIAamp DNABlood Midi Kit提取基因组DNA。质检合格的基因组DNA使用Covaris S2超声波仪(USA)将基因组DNA打断成200~ 250 bp的片段，对制备的DNA片段随后进行Ampure Beads纯化，使用T4 DNA聚合酶、T4磷酸核苷酸激酶、Klenow聚合酶，对DNA片段进行末端修复，然后按照Illumina标准流程使用dATP和Klenow 3，-5 7 exo - enzyme增加末端A碱基，随后进行DNA片段的接头连接，接头连接模板使用Agencourt AMPure SPRI beads进行纯化。纯化过的DNA片段经过LM-PCR进行扩增和纯化，使用生物素化寡DNA核酸探针人全外显子捕获系统进行目标序列捕获，被捕获的片段随后进行LM -PCR反应，生成测序用的DNA库。该捕获系统可捕获PAH基因的全部外显子加上外显子两侧翼的10 bp。使用Agi-lent 2100 Bioanalyzer and ABI stepOne对生成的测序DNA库进行富集度的检测，合格的DNA库与Illumi-na测序flow cell上的互补接头进行杂交。DNA库在Illumina HiSeq2000测序平台上使用高保真DNA聚合酶进行扩增并进行高通量测序，连续双向测序90个循环。每个样本的平均测序深度大于100×以保证信息分析要求。使用Illumina basecalling软件(版本1.7)进行原始图像数据处理，测序数据分析使用—lumina分析流程。每条测序序列产生90 bp的双向测序读长。

　　1.2.4突变命名和验证 已知突变的命名结合测序结果参照http: //pahab. mcgill.ca提供的突变名称命名。新序列变异通过查阅PAH相关数据库(http：//www. biopku. org/pah和http://www. m:bi. nlm. nih.gov/pubmed)来确定，所有新变异均通过100名健康无关个体相应外显子测序排除为多态性位点后被认定为新突变。新突变命名参照http: //www.hgvs. org/mutnomen提供的命名法来命名。

　　1.3统计学分析采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料以率(%)来表示，组间比较采用疋2检验。　

   　2结果

　　2.1 新疆地区维吾尔族、回族PKU患儿PAH基因突变类型及特点 见表1、表2。

　　通过PCR产物直接测序法(24例)、基因芯片捕获和二代高通量测序技术(23例)共对47例PKU患者的PAH基因突变进行检测分析。在33例维吾尔族PKU患者PAH等位基因中共检出27种致病基因突变，总检出率为89. 40/0(59/66)，主要包括错义突变14种(51.9%)、剪接位点突变8种( 29. 60/0)、无义突变4种(14.8%)、缺失突变1种;患儿突变等位基因主要分布在5 7非编码区、第3~8、10~ 12外显子和第7-8、10 -12内含子中，但大部分突变主要分布在外显子7(15.2%)、外显子12(15.2%)、外显子6(13.6%)、外显子5(9.1%)、外显子3、1 1(均占6. 1%)和第10、1 1内含子区域(分别为6. 1%、4.5%)，这8个热点突变区域占总突变数的75. 8c/0(50/66)，常见的致病突变是R413P(12. lc/o)、R243Q (9.1%)、EX6 - 96A>G(7. 60/0)、 F161S (7.60/0)、 IVS10 - 11G>A(6.1%)、P281L(4.5%) 和1VS11 - 2A>C(4.5%)，这7种常见突变占总突变数的51. 5%( 34/66)。

　　在14例回族患者PAH等位基因中共检出19种致病基因突变，总检出率为89. 3%(25/28)，主要包括错义突变13种(68.4%)、剪接位点突变2种( 10.5 010)、无义突变2种(10.5%)、缺失突变1种、插入突变1种;患儿突变等位基因主要分布在第13、5~8和11~12外显子中，但大部分突变主要分布在外显子6(21.4%)、外显子7(17.9%)、外显子8、5、11、12(均占7. 1%)，这8个热点突变区域占总突变数的75. 0%(21/28)，常见的致病突变是R155H、R176X、R241C、R243Q、A300S和R413P(均占7.1%)，这6种常见突变占总突变数的42. 90/0(12/28)。

　　2.3 新疆地区维吾尔族、回族PAH基因常见突变频率与其他国家和地区的比较见表3。新疆维吾尔族PKU患者常见的PAH基因致病突变是R413P(12.1%)，与日本类似(30.5%)，但不同于中国汉族、韩国PKU患者的常见突变为R243Q，也不同于欧洲国家常见突变为R408W。新疆维吾尔族PAH基因R243Q突变检出率显著低于中国北方(X=5. 738 4.P=O. 016 6)，但F161S、IVS10-11G>A和2297.P281L突变检出率则显著高于中国北方(2=8. 235 7,P=0.004 1;X2= 11. 594 8，户=0.000 7:X2=6. 452 8，P=o011 1)。新疆维吾尔族与韩国、日本相比，R413P突变检出率有显著性差异(X2=5. 291 3,P=0.021 4;X2=7. 119 8,P=0.007 6),新疆维吾尔族IVS10-11G>A突变检出率显著低于伊朗、以色列(X2= 5.628 7，P=0.017 7;X2=11. 382 2，P=O. 000 7)，P281L突变检出率显著低于伊朗、冰岛(X2= 7.283 4，P=O.007 0;X2=3. 877 2，P=0.048 9)。在欧洲常见的P281L和IVS10-11 G>A突变在新疆维吾尔族中也常被检出，IVS11 -2A>C突变在中国北方主要存在于维吾尔族中。R155H仅在回族中检出，可能是新疆回族独有的PAH突变类型。新疆维吾尔族与回族相比在PAH基因突变构成上有所差异。

　　表2新握地区回族PKU患者PAH基因突变检测结果(14例)

　　2.3 新疆地区维吾尔族、回族PAH基因新突变。经检索国内外文献及PAH相关国际数据库( http: //www. biopku. org/pah)，证实新疆地区回族中检测出的MlI(c.3G>T)是国际上尚未见报道的新的PAH基因突变，并已提交国际PAH突变基因数据库，T81N((：.242C>A)、V230A(c.689T>C)和L348V((..1042C>CJ)突变为国内首次报道。

　　3讨论

　　研究17-211 I表明，不同国家、地区及民族间PAH基因的突变特点和规律不尽相同，表现出PAH基因突变的复杂多样性。本研究发现新疆维吾尔族、回族PAH突变基因检出率分别为89.4%、89. 3%，与天津宋力等(94%)和北京瞿宇晋等23一(95%)相比，突变基因检出率较低，但显著高于内蒙古张军力等。24I所报道检出率(61%)。认为一方面可能与所采用方法有关，研究标本中仅有23例采用基因芯片捕获和二代高通量测序技术进行测序，如再联合采用高分辨熔解曲线和多重连接依赖探针扩增技术，可显著提高PAH突变基因的检出率，另一方面，本研究24例标本采用Sanger法测序，推测新疆地区维吾尔族和回族某些突变可能存在于本方法扩增区域之外，如与基因表达密切相关的顺式作用元件、反式作用因子等，PAH基因启动子或增强子的序列改变也会影响PAH基因表达的效率。

　　本研究在新疆地区33例维吾尔族和14例回族PKU患者中分别检测到27种、19种PAH致病基因突变，突变检出率分别为89. 4%、89.3 010，显著高于王慧琴等25的报道(65.9%)。突变大多分布在PAH基因5 7非编码区、第1~3、5—8、10~12外显子及其两侧内含子区域，而常见的突变比较集中在第6、7、12外显子，与日本人类似，但与欧洲人集中在第3、10和12外显子明显不同，这充分表明新疆维吾尔族和回族PAH基因突变的高度异质性。另外，研究还发现R413P是新疆维吾尔族常见的突变，显著区别于中国北方、南方汉族常见突变分别为R243Q、EX6-96A>G，提示不同民族间PAH基因突变构成的显著差异。此外，研究还发现在欧洲中普遍存在的P281L和IVS10-1lG>A突变在新疆维吾尔族患者中被检出，而新疆维吾尔族和回族中检出的IVS11 -2A>C和在中国北方、南方汉族及欧洲、拉丁美洲等国家的研究中都未有报道，IVS11 -2A>C和R155H可能分别是新疆维吾尔族、回族独有的PAH基因突变类型。新疆维吾尔族、回族PAH基因突变构成总体上与中国北方比较类似，与中国南方稍有差异，但显著区别于欧洲、南美及中亚等国家及地区，分析原因可能与新疆维吾尔族和回族的民族起源、融合发展有密切关系，这对于制订不同民族的PKU基因诊断方案及PAH基因突变起源研究具有重要参考价值。新疆维吾尔族是我国历史悠久的少数民族之一，早在公元前3世纪曾游牧于我国北方和西北部以及贝加尔湖以南、额尔齐斯河和巴尔喀什湖之间，是古代回纥人的后裔。公元9世纪中叶大举迁徙至内地，大部分迁到新疆天山南北。P281L和IVS10-11G>A突变出现在维吾尔族家系中，其遗传因子当是西方基因迁徙和融合的结果。新疆回族主要来源于中亚和国内北方省区，随着古丝绸之路的形成和发展，逐渐融合了汉人、蒙古人、阿拉伯人、波斯人以及中亚其他信仰伊斯兰教民族人种的血缘，通过长期以来与当地各族人民相濡以沫、休戚与共所建立的密不可分的血肉联系而融合发展而来。通过研究我们发现，受历史、地理及民族等诸多因素的影响，新疆的PAH突变基因已形成了我们与亚欧之间一个较为特殊的分布带，具有鲜明的民族和地域特征。

　　本研究还发现MlI这种PAH基因新突变，经检索国际PAH基因突变数据库(截至2017年6月29日)，确认为中国人群中存在的国际上首次发现的PAH基因新突变。PAH蛋白通常以具有催化活性的四聚体形式存在，四聚体是由两个二聚体组成，酶单体由N端调节区( l-142aa)、催化区(143 -410aa)及C端的四聚体区(411-452aa)三部分组成。PAH基因突变对酶蛋白活性的影响依赖于突变的形式和位置。本研究发现的新突变Mll(c.3G>T)属于错义突变，位于酶单体蛋白的调节区域，是由于编码区第3位的鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代后，使得第1位编码甲硫氨酸的密码子( AUG)变成了异亮氨酸的密码子( AUU)，改变了苯丙氨酸羟化酶的结构并影响了酶活性功能。T81N(c.242C>A)、V230A(c.689T>C)和L348V(c.1042C>G)这3种突变均为错义突变，目前国内尚未有相关报道在维吾尔族和回族PKU患者中检出，也进一步提升了新疆维吾尔族和回族PAH基因突变的多样性、复- 2300杂性和特殊性，这三种突变也是在两个民族患者中首次发现。

　　新疆地区维吾尔族和回族检出的PAH突变基因的构成复杂多样，既包含我国北方地区常见的突变类型，与我国南方部分省区PAH突变基因的分布特征也有所差异，也显著区别于日本、韩国、欧洲、美洲等国家及地区的PAH基因突变分布特点，呈现明显的民族地域特色。本研究基本明确了新疆地区维吾尔族和回族PAH基因的突变类型、频率及特点，为新疆地区PKU的研究提供了重要补充资料，这对于有效降低本地区PKU发病率、减少PKU患儿的发生、提高人口素质具有重要价值。

　　参考文献

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