环腺苷酸结合蛋白在心脏功能及相关心脏疾病中的作用研究进展

　　环腺苷酸结合蛋白在心脏功能及相关心脏疾病中的作用研究进展

　　王鑫，董六一

　　关键词：心脏病

　　环磷酸腺苷(cAMP)是心血管系统中细胞对于外界刺激反应的关键信号分子。它控制很多生物效应，如细胞增殖、变异和凋亡等。cAMP是ATP通过跨膜腺苷酸环化酶激活的G蛋白偶联受体l1]I。细胞内cAMP不仅由腺苷酸环化酶，而H山cAMP的磷酸二酯酶调控其降解，催化cAMP水解成5-AMP。磷酸二酯酶是限制cAMP合成的关键因素，并且是各种特定反应动态微小区域的关键组成部分引。研究显示，细胞内cAMP效应与蛋白激酶A( PKA)及环核酸门控离子通道相关联。1 998年，一种新的cAMP受体蛋白被发现，即环腺苷酸结合蛋白(EPAC)。EPAC家族山作为小分子G蛋白Rap的特异性鸟嘌呤核苷：酸交换因子((jEF)的EP人C1和EPAC2组成，其功能与PKA平行。F.P AC可促使j磷酸鸟苷( GDP)转变为三磷酸鸟苷((jTP)，从而激活小分子。相反，激活蛋白提高了内在GTP水解活性，使Rap转化为无活。阽的GTPasc。Rap在有活性和无活性状态的转换形成其与效应蛋白结合的主要机制。EPAC的发现打破了关于’与PKA的传统观点，并揭示cAMP信号在心血管系统中新的作用。这些cAMP敏感的GEF在不同亚细胞器及细胞内环境中的功能将逐步闸明，诸多研究表明，EPAC与cAMP的多种生理反应相关联，例如心肌肥大和血管炎症等。我们将刈EPAC在心脏中的功能及相关心脏疾病中的作用进行综述，并探讨EPAC配体在相关心脏疾病中的治疗潜力。

　　1 EPAC

　　1.1 F.PAC基因和组织分布FPAC在1 998年由2个独立组织分别发现。他们初研究发现，cAMP产生的Rap对PKA的抑制反应并不灵敏。De Rooij等在cAMP结合位点及GEF蛋白同源基冈组序列编码域辨别出，并命名为EPAC(与FPAC1哑型相一致)。EPAC1和另1个EPAC亚型EPAC,2存富含cAMP结合导向蛋白的大脑皮质微分显示中被发现。第一种亚型命名为REPAC(与EPAC相关)已经被鉴定，然而此种蛋白缺乏在EPAC1和EPAC2中同时表达的cAMP依赖调控序列_]。F.PA C,l和F.PAC2各自通过Rapgcf3和Rapgef4基因编码，并具有相似的遗传构成。Rapgcf3转录导致1个4 kb的mRNA合成，然而替代促进剂的使用和Rapgef4的差异拼接形成了3种不M的F.PAC、2亚型(EPAC2A，EAPC2B，EAPC2C)引。

　　随研究的深入及病理生理学的进展，FPA C,l和FPA(、2表达谱呈现差异性表达。EPAC1在心脏、血管、r宫、肾脏和巾枢神经系统都有极高表达。相反，Rapgcf4选择性启动子的遗传调控导致EPAC2业型的限制性表达，EPAC1相似结构域的FPAC2B在肾上腺及胰岛lIl被发现，而EPAC2C的mRNA只在肝脏巾被发现。F:PAC2A(初名为EPAC2)表达较明碌，此种EPA(:业型在大脑、内分泌系统(如垂体和胰岛细胞)中被发现。

　　1.2 已有研究表明，EPAC1和EPAC2表达水平的变化髓穿整个生长发育过程711。EPAC1和F.A P(、2均在小鼠胚胎心脏中发现，但显示不同的表达潜。在一些肾脏或者心脏器官中，EPACl/F.PAC2比值在成年动物体要远远高于胚胎器官，表明这2种蛋白对器官生长和功能作用有所小。EPAC调节的潜在分子机制虽然并小清楚，但各种研究表明，EPAC1和F.PAC2表达水平会随着病理生理学的状况而改变。关于心脏重构，在异丙肾上腺素引起的左心审肥大及压力负荷引起的心肌肥大，EPAC1及少量FPAC2水平I：升“引。使用EPAC1激动剂引起细胞功能性缺氧因素的研究表明，缺氧条件下EPAC1发生变化”，在人体心脏表达的主要亚型，在心力衰竭患者左心察达，提示其在心脏重构后期的潜在作用州1。在小鼠股动脉损伤后，血管内膜增生区域只有EPAC1上调ill。冈此，FI I)A(1表达异常及在心血管重构表现出的亚型表达失衡，提示其在心血管疾病进程中与cAMP-(;EF的潜在关联作用。

　　1.3 EPAC特有配体 EPAC选择性药理调节因子的发现是研究EPAC信号和生物学功能的重大突破。当前，特定的FJIJ AC激动剂是对cAMP进行修饰所得化合物。能够辨别EPAC和PKA的第一代cAMP类似物，是在观察到2羟基cAMI’不能与EPAC结合，但能与PKA及其他cAMP直接效应器结合的基础上合成的”1。能够代替2端临界位置的cAMP类似物可以识别EPAC特定、有效的激活剂8一(4-chlc)ro-phenylrhio) -2'-()-mcthyladenosine-3’，5Lcyclic monophosphate，其对PKA无激活作用。这种化合物缩写为F.P AC激动剂，其对EPAC的选择性较PKA强100倍，在EPAC功能特征化中已经广泛使用。EPAC激动剂对FPACl激动效应较cAMP有效，但其兴奋EPAC2弧型效果较cAMP差1胡。近期，Tsalkova等‘1 91建立了荧光高通量筛选去辨别EPAC特定的、通过与EPAC1及EPAC2结合能直接与荧光cAMP类似物8-NBD-cAMP竞争的抑制剂。非环状核背酸化合物ESI-08是第一个EPAC抑制剂，且在与cAMP相同摩尔浓度(25 Umol/I,)条件下就能够抑制EPA(:,1和EPAC2活性卫。进一步研究表明，ESI-05及ESI-07足特定抑制EPAC2，但对F.PACl无抑制作用的抑制剂亚型，推测是通过与EPAC2中由2个C,NBD组成的接口相结合起到抑制作用”。另1个ESI-09分子通过CNBD-B的1个接【J对EPAC,1和F.PAC,2-GEF活性进行抑制”。然而，F.SI-09可能对EPAC无选择性作用，只是一种非选择性蛋白抑制剂，尤其在使用高浓度时这种非选择性表现的更加明显”。

　　2EPAC在心脏中的功能和相关心脏疾病中的作用

　　2.1 EPAC对心肌兴奋一收缩偶联的影响

　　Ca2+是心脏生理功能中重要的第2信使，它通过兴奋收缩偶联机制调节心脏收缩功能。心肌细胞膜上电压敏感的I。型C矿通道激活，可促使外Ca21内流，并与内质网上的雷诺定受体( RyR)结合，诱导内质网钙库释放Ca”，为激活肌原纤维的收缩提供必要的。细胞收缩后细胞质中的Ca2+通过内质网上C.a"泵或通过Na一/Ca'。‘交换被快速泵川内质网r23]。交感神经系统通过去甲肾上腺素和肾上腺素及其突触后膜p肾上腺素受体作用于心脏,心脏内神经末梢激活p受体从而促进去甲肾上腺素释放，心肌细胞内cAMP水平升高，增加PKA活性。PKA通过调节兴奋收缩偶联蛋白以增加心脏收缩和舒张作用。PKA促使I。型Ca2通道磷酸化，刺激Ca2+电流振幅，从而触发内质网释放Caz+诱导肌丝收缩。PKA在丝氨酸16磷蛋白的磷酸化作用，缓解其对内质网Ca2+相关ATP酶活性的抑制作用，提高内质网(松弛效应)中Ca2+摄取速率。此外，PKA对肌丝蛋白磷酸化的影响也降低Caz敏感性和促进松弛以调节收缩性…}]。 Morel等研究显示，EPAC特异性激动剂在新牛大鼠心室肌细胞中产生Ca2+瞬变。随后在成年大.鼠体外心肌细胞中研究发现，EPAC可增加自发钙火花频率或局部Caz+瞬变。RyR激活可出现钙火花并导致Caz从内质网中释放“。通过钙火花引起内质网中Ca2+渗漏增加，导致存储在内质网中Ca2。+数量减少，从而诱发Ca2+瞬变振幅减少o。EPAC激活对C铲渗漏的影响独市于PKA，但需要钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活，使RyR关键的丝氨酸残基磷酸化(Ser2815或Ser28lil)，其对I。型Ca电流或通过Na /Ca2"质子泵的Ca2迁移尢显著影响。

　　大多数研究认为，在应对急性口受体刺激时，EPACj参与此过程的主要cAMP效应器PKA相比不起主要作用。然而，EPAC激活引起依赖CaMKⅡ的RyR敏化，并诱导内质网Ca2+渗漏，这是导致心肌缺血再灌注损伤、心律失常、病理性心肌肥厚和心力衰竭的重要机制之一。。

　　2.2 EPAC与心肌缺血再灌注损伤 已有研究表明，线粒体中同样产生cAMP。由可溶性腺苷酸环化酶产牛的cAMP在线粒体基质中激活PKA，从而导致细胞色素【：氧化酶亚基Ⅳ的磷酸化，进而增强氧化磷酸化，促进ATP合成。31-32。除了合成ATP，线粒体在细胞其他牛理过程小也起着至关重要的作用，如Caz缓冲，活性氧产生和细胞捌亡”。心肌缺血再灌注是一种临床相关的心肌损伤，其L{，线粒体Caz+超载和过虽活性氧产生，使线粒体通透性转移孔开放，导致线粒体去极化和心肌细胞死亡31I I。大多数研究表明，cAMP信号对细胞凋亡的影响主要通过PKA。F.PA C.l在缺血性心力衰竭患者心脏样本中表达上调，而其遗传缺失则显著降低缺血再灌注或缺氧复氧损伤引起的心肌细胞梗死;通过基因敲除或者EPAC1抑制剂则能抵抗由缺血冉灌注引起的心肌细胞凋亡。相关研究表明，FPAC,l是由可溶性腺苷酸环化酶激活，并在缺氧复氧期间促进线粒体通透性转移孔开放和细胞凋亡;EPAC1参与调节线粒体各方面功能，如Ca2摄取、活性氧产生和线粒体通透性转移孔开放。近研究表明，F.PACl的各种生物学行为取决于其亚细胞定位。心肌细胞内EPAC,1的核周定位与心肌肥厚重构过程中基因转录调控的作用是一致的“3 7]。后，FPACl在F.PACl转染的cos- 7细胞线粒体中被发现，尽管它与任何生物学功能没有联系L3EiJ。研究发现，EPAC1在心肌细胞线粒体中，通过由可溶性腺苷酸环化酶产生cAMP激活，在心肌细胞死亡中发挥重要作用。2.3 EPAC与心肌肥大 高血压和心肌缺血再灌注损伤可促进病理性心肌肥厚，常导致心力衰竭，并与心脏猝死有关，这是心脏疾病发病和死亡的主要原因【州。尽管急性刺激B受体有益于心脏，然而，慢性激活此途径可引发病理性心脏重构，并町能终导致心力衰竭”。研究显示，慢性心力衰竭与高水平儿茶酚胺有关，而儿茶酚胺与生存呈负相关。异常cAMP信号导致心脏重构和心力衰竭r4i-。因此，当前的研究旨在确定cAMP结合蛋白EPAC在慢性8受体刺激下心脏病理过程中的作用。

　　EPAC(主要是EPAC1)在不同心脏疾病的动物模型中均表达增加，在心力衰竭患者左心室样本中表达同样增加，由此得出FPAC在病理性心肌肥厚中有潜在作用引。体外实验显示，EPAC参与心肌细胞生长。直接用EPAC激动剂激活内源性FPA(:或EPAC1过表达，增加了各种肥大的标志物，如细胞表面积、蛋白质合成及心房利钠因子表达。在成年大鼠体外心肌细胞中证实r EPAC1的致肥大作用8i。异j+基甲基黄嘌呤，一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，可加晕EPAC1诱导的肥大作用，提示磷酸二酯酶是EI，AC肥大信号的关键调节器”。近一项研究表明，EPAC1是原发性心肌细胞中引起辐射诱导肥大的潜在中介，这表明cAMP-GEF与抗癌治疗的副作用有关”。

　　在成年大鼠体外心肌细胞中发现，8受体激活F.PACl后以独立于PKA的方式引起肥大，在此前提下假设除了经典的cAMP/PKA通路，在某些病理生理情况下，B受体刺激可能激活EPAC信号通路¨。这一假设已经在EPAC1敲除小鼠体内得到』，部分证实。敲除EPAC1可抑制心脏质量增加及由G受体持续激活引起的遗传标记的肥大基因上调叫。EPAC1基因敲除小鼠显示，在8受体慢性激活条件下心脏收缩功能得到改善州。同样，缺乏EPAC1(而非F.P AC2)的小鼠也会在其他形式压力下对心脏起保护作用，例如压力超载和诱发心脏功能障碍”-。PAC1抑制剂可抑制磷脂和RyR2高度磷酸化，由此可以推测EPAC1抑制剂可能在慢性B受体激活引起的心力衰竭中恢复C,a2+循环正常化的新手段，这可能是对当前日受体阻滞剂治疗心力衰竭的替代治疗方案，这个假设需要进一步验证。与在应激条件下FJPACI缺乏对心脏功能的有益作用相致，在EPAc1敲除小鼠中，可减轻异丙肾I：腺素或横向手动脉缩窄引起的心肌纤维化。

　　2.4 EPAC与心脏重构

　　研究结果表明，FPAC激活改变了钙稳态。小鼠体内心脏实验研究表明，FPAC激动剂口r诱导室性心律不齐。Brette等”1研究表明，由于对稳态钾电流的抑制作用，F.PAC的药理学激活可引起动作电f谚延长。对豚鼠心室肌细胞的研究进一步阐明了EPAC在心脏重构中的作用，研究结果显示，持续的G1受体刺激，激活FPACl，降低延迟整流K+电流的密度，延迟整流K+电流系统对心脏复极化至关重要，减少整流K一促进心肌细胞的心律不齐。EPAC1对整流K+的影响发生在基凶水平.其通过钙调磷酸酶及其下游效应物(激活T细胞的核岗f.)下调整流K亚单位钾电压门控通道F成员1的编码。在体外大鼠心室肌细胞中，EPAC町增加2个瞬时感受器电位通道表达(瞬时感受器电位3通道和4通道)。通过这些通道内流可能加重EPAC引起的心律失常效应17。在体内实验中，采用选择性药理学调控EPAC等形式可以更好地鉴别EPAC1和EPAC2在心律失常中的作川。除改变对Caz+的处理方式外，EPAC信号也可以通过其他机制起心律失常。一些研究报道，EPAC调节心室连接蛋门缝隙连接蛋白43的表达和定位，从而影响缝隙连接的控制功能。缝隙连接蛋白43在调控心肌细胞一细胞偶合和搴性心律失常的发病机制中起晕要作用，推测EPAC、可能通过改变缝隙连接的形成来促进心肌重构。

　　3结 论

　　EPAC1和EPAC2被认为是cAMP的重要效应器。EPAC激动剂及其衍生物的许多功能都已在细胞巾被鉴定。包括血管细胞增殖和迁移，内皮屏障渗透率和(：a2处理。与EPAC相关的一些生物学效应，如心肌细胞肥大和心律失常，在动物模型I：被证实EPAC发挥重要作用。然而，山于EPAC转基因小鼠模型的出现，-些相互矛盾的结果，这可能与动物遗传背景、F.PAC荩冈敲除后产物及cAMP信号的复杂性有关。关于F-.P AC亚刑特异性配体的药理学和遗传学研究需进一步深入探讨，以便更好地r解EPAC在心血管系统中生理和病理牛理功能。大量效应蛋白结合从而进入各种亚细胞器。FPA(、分子复合物或在不同亚细胞器存在明确信号通路，它们影响硒部cAMP信号和特定细胞功能。EPA(:与业细胞器特异性蛋白相互作用及cAMP的空间动力学决定r EPAC、功能效应的关键分子机制。在心肌细胞中EPAC已经被证明可以影响内质网和核的Ca2-处理，肥大基因表达和高尔基体受体的转运。然而，我们对EPAC认识仍处于初级阶段，FPA在其他细胞器的作用，需要在正常心肌细胞和病变心肌细胞中进一步深入研究。近研究表明，EPAC参了相关心脏疾病的过程，这提示EPAC可能是潜在治疗各种心脏疾病的有吸引力的治疗靶标。例如，药物抑制FPA C.l可减缓心脏重构，并有效治疗心律失常和心力衰竭，这可能与口受体阻滞剂有协同作用。迄今为止，上述大多数EPAC拮抗剂已成功在体外进行生化测定，但需进一步进行X线结晶学和磁共振波谱学的优化。在其作为有价值药理学探针阐明EPAC在心血管系统中的生理和病理生理作用之前，需进一步改进EPA配体的特异性和生物有效性。此外，未来基础和转化研究方面也需进一步阐明EPAC拈抗剂可能产生的副作用。

　　上述研究显示，尽管口前对EPAC做了大量基础研究，但仍有很多方面需进一步深入研究。例如未来的研究应致力于确定EPAC表达调控所涉及的潜在分子机制，EPAC表观遗传调控作用及人类EPAC基因变异与心血管疾病的潜在联系等。因此，EPAC仍然有着巨大的研究价值和理论意义。