瘦素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

　　瘦素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

　　王丽，方天富，郭宝亮，薛陆静

　　关键词：瘦素;脂联素;肌细胞，平滑肌;细胞增殖;细胞凋亡;冠状动脉疾病

　　瘦素结构上属长链螺旋细胞因子家族，具有广泛的生物学效应，主要作用于下丘脑的代谢调节中枢，发挥抑制食欲，减少能量摄取，增加能量消耗，抑制脂肪合成等作用”。血清瘦素被认为是反映机体总体血脂水平好的生物指标之一，与冠状动脉事件密切相关心”。本实验旨在探讨瘦素在冠状动脉粥样硬化性心脏病发病中的作用机制，为临床工作提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器瘦素脂联素试剂盒、四甲慕偶氮唑盐、二甲基亚砜( Sigma，USA);DMEM培养液(高糖)、RNaseA( Gibco，USA);流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

　　1.2方法无菌摘取大鼠胸主动脉m管平滑肌组织，用贴壁法进行细胞的原代培养。血管平滑肌细胞( VSMC)用胰酶消化法进行传代并[j然纯化，实验用第4～6代细胞。按照不同浓度瘦素的处理方法，将细胞分为对照组、小剂量组(瘦素40弘g/I。)、巾剂量组(瘦素80tlg/I.)、剂量组(瘦素100 p∥I.)及联合组(瘦素100 )ug/I.+脂联素30 mg/I))，孵育24 h后检测相关指标。对照组细胞不做任何处理。

　　1.3 VSMC增殖测定

　　采用四甲基偶氮唑盐比色法检测VSMC。在96孔细胞培养板每孔中加入0.1 ml含靶细胞的培养液，在37℃、5%C()。培养箱中培养24 h后换含有瘦素的培养液。孵育24 h后弃去培养液，n Hanks液洗涤1次，每孔加入0.1 ml D-Hanks液和10“1四甲基偶氮唑盐染液，在37℃、5% C(L培养箱中继续培养4 h。弃去所有上清，每孔加入o.1 ml二甲基亚砜，在振荡器上震荡混匀，让还原产物充分溶解，置于酶联检测仪上测定各孔于490 nm处的吸光度。

　　1.4增殖细胞核抗原( PCNA) mRNA表达水平检测

　　各组细胞采用Trizol提取总RNA。RNA纯度和浓度采用紫外分光度法测定。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定啭分析。

　　1.5 细胞凋亡率检测

　　采用Annexin V-FITC,检测细胞凋亡率。VSMC按l×10"/7L接种于4个6孔板培养24}1，冉加入纯的DMEM培养24 h，换无血清培养液。将细胞趾于培养箱中培养118 h后，用胰酶消化吸收细胞离心5min。弃上清液后转移至标记好的离心管中。每管中加人人nnexlnV- FITC轻重悬细胞，加入碘化丙啶避光反应10 min，随即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.7统计学方法采用SPSS 15.O软件，计楚资料以x±N表示，组间比较用，检验，采用Spearman相关性分析，P<0. 05为差异有统计学意义。

　　2结 果

　　2.1 各组VSMC增殖率和凋亡率的比较与对照组比较，小、中、大剂量各组及联合组VSMC增殖率可J显升高，VSMC凋亡率明显降低(P 中剂量组与大剂量组VSMC增殖率明显高于联合组，VSMC凋亡率明显低于联合组(P

　　表1各组VSMC的增殖率和凋亡率的比较(x±s)

　　血清瘦素水平与VSMC增殖呈正相关(r—0.37，P<0. 05)，与VSMC凋亡率呈负相关(r= -0. 19，P

　　2.2 各组细胞PCNA mRNA与caspase-3 mRNA表达水平比较 与对照组比较，小、巾、大剂量各组及联合组PCNAmRNA表达水平明显升高、caspase-3 mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。小、中、大剂量各组PCNA mRNA表达水平逐渐增加，caspase-3 mRNA表达水平逐渐下降( P mRNA表达水平有下降，caspase-3 mRNA表达水平有增加，差异有统计学意义(P

　　3讨论

　　肥胖和高血脂是冠心病的重要危险因素。肥胖患者体内多种细胞岗子、激素等均可能在粥样斑块的形成和发展中具有重要的作用。其中瘦素是一种由肥胖基因编码，脂肪细胞分泌的非糖基激素，其主要功能是调节食欲控制机体脂肪沉积。有研究发现，瘦素水平与冠状动脉粥样硬化可能有密切的关系㈠。脂联素则是由脂肪组织分泌的一种代谢调节凶子，具有促进葡萄糖利用和脂肪酸氧化，降低血糖，改善胰岛素抵抗等功能。脂联素与严重颈动脉狭窄患者发生不良心血管事件的风险降低有关o。Selthofer-Relati∈等研究80例超重非糖尿病患者发现，瘦素/脂联素比值町能是肥胖早期动脉粥样硬化的危险标志物。

　　冠状动脉粥样硬化的发病机制尚未完全明了，VSMC增生和凋亡在动脉粥样硬化斑块形成过程中极为重要，纤维斑块中的主要细胞成分是平滑肌细胞，它能合成分泌结缔组织的基质，也能蓄积脂质而成为，肌源性泡沫细胞。平滑肌细胞的激活，从中膜层到内膜层的增生和迁移是动脉粥样硬化发生发展的重要因素，也是血管结构改变的主要原因。P(:NA又称周期蛋白，是DNA复制的必须成分，其表达与细胞增殖活性有关，已成为评价细胞增殖状态的·项客观指标。静止细胞中PCNA含量相当少，C.期开始明显增加，S期达到高峰，G。期和M期明显下降。caspasc-3在细胞凋亡巾起着不可替代的作用，在发生凋亡的细胞提取液后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的caspase-3它又能恢复致凋亡的功能。

　　本研究结果显示，财照组、小剂量组、中剂量组、大剂鞋组VSMC的增殖率逐渐升高、凋亡率逐渐降低。巾剂量组与大剂量组VSMC的增殖率明显高于联合组，VSM凋亡率明显低于联合组，提示瘦素对VSMC的促增殖效应旱剂量依赖性，脂联素对该效应有抑制作用。Spearman相关性分析硅示，瘦素血清水平与VSMC的增殖率呈正AH关。瘦素血清水平与VSMC的凋亡呈负相关。瘦素对VSM有抑制作用，且呈剂量依赖性，脂联素刈该效应有抑制作用。

　　综上所述，瘦素可以促进平滑肌细胞的增殖，抑制平滑肌细胞凋亡，这一作用可以被脂联素所抑制。虽然已经明确瘦素是冠心病发病的危险因素，但足具体的作用目前尚不清楚，有待于进一步的深入研究。

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