钙敏感受体在人参皂苷Rgl防治心肌细胞损伤中的作用

　　钙敏感受体在人参皂苷Rgl防治心肌细胞损伤中的作用

　　郁盛雪，杨依玲，左中夫，鲁美丽，吕涛，刘学政

　　关键词：受体，钙敏感;人参皂甙类;肌细胞，心脏;异丙肾上腺素;普萘洛尔

　　心血管疾病现已成为威胁人类健康的头号杀手，其病理过程所共有特性是心肌损伤，心肌肥厚。长期心肌肥厚是诱发各种心脏病、心功能衰竭及猝死的主要危险因素，其发病机制和防治一直是国内外心血管领域攻关的主要难题和研究热点。现国内外学术研究认为，细胞内Ca2+是各种原因导致心肌肥厚的始动因素口]。钙敏感受体( Calci-um-sensing receptor，CaSR)初是Brown EM等发现并从牛甲状旁腺克隆出的一种G蛋白偶联受体，主要分布于肾脏、甲状旁腺、骨组织及其他细胞如胰腺B细胞等。Ca2+是第一个被发现可以通过激活CaSR而发挥作用的物质。CaSR通过对Ca2+的调节参与了机体生理病理过程口。异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)是一种强效8受体激动剂，长时间刺激会导致心肌细胞蛋白合成增加，体积增大，终导致肥厚的发生。基础研究常用ISO作为模拟心肌肥厚的刺激药物。

　　人参皂苷Rgl具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗应激及心血管保护作用‘6]。现有研究证实了人参皂苷Rgl在治疗大鼠贫血模型时，其皂苷成分可使外周血液中干细胞数量显著增加，促进干细胞归巢梗死细胞分化成心肌细胞样细胞，减少心肌梗死面积，明显改善心室重构，促进心肌再生，对受缺血损伤的心肌恢复起促进恢复作用，并对缺血性心肌结构进行保护。这些研究说明，人参皂苷Rgl对心肌的修复保护作用，其机制可能与对心肌Ca2+稳态的调节及抑制炎性反应和炎症通路有关。CaSR活性增强能够使细胞内Ca2+稳态被破坏，诱发线粒体应激引起心肌细胞凋亡。因此，本研究重点探讨CaSR在人参皂苷Rgl防治心肌损伤中的作用及保护机制。

　　1材料与方法

　　1.1 药物与试剂

　　人参皂苷Rgl为宝鸡市辰光生物科技有限公司产品，纯度98%，批号：20160 315。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗体购自于Abcam公司，f3-actin抗体、二抗购于Proteintect公司，CaSR、ISO、鬼笔环肽、普萘洛尔(Propranolol，Pro)、低糖DMEM培养基购于Sigma公司，胎牛血清购于Hyclone公司，线粒体膜电位检测试剂盒JC-1、BCA蛋白检测试剂盒、增强化学发光检测盒(ECL)购于上海碧云天生物技术有限公司。

　　1.2仪器

　　细胞微孔板成像系统Cytation5(美国Biotek公司);倒置荧光显微镜及倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司);电泳仪、垂直电泳槽及化学发光凝胶成像系统(美国伯乐公司);二氧化碳培养箱(Thermo公司);低温高速离心机(购自德国Sigma公司)。

　　1.2 细胞与分组

　　大鼠新生乳鼠心脏组织H9C2心肌细胞株由辽宁中医药大学药理学教研室馈赠，置于含有双抗(100 U/ml青霉素、链霉素)、10%胎牛血清和90% DMEM培养液中培养，实验分为：(1)对照组：未加任何试剂培养;(2)ISO组：正常心肌细胞加入IS0 10 timol/L作用48 h;(3)低剂量组：加入人参皂苷Rgl 20 tj_mol/L.预孵育30 min，加入IS0 10 y_mol/L，作用48 h;(4)中剂量组：加入人参皂苷Rgl 40 tjmol/L预孵育30 min，加入ISO10tlmol/L，作用48 h;(5)高剂量组：加入人参皂苷Rgl 80 timol/L预孵育30 min，加入IS0 10 ymol/L，作用48 h;(6)普萘洛尔组：正常细胞中加入普萘洛尔2 rLmol/L预孵育30 min，加入IS0 10 tLmol/I，作用48 h。

　　1.4方法

　　1.4.1 细胞骨架染色观察细胞体积

　　各组心肌细胞加药培养48 h后，弃掉板孔内培养液，磷酸盐缓冲液清洗3遍，加入4%的多聚甲醛固定，固定时间30 min后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，加入1%的牛血清白蛋白室温封闭30 min。倒掉封闭液，加入鬼笔环肽避光染色20 min，磷酸盐缓冲液清洗3遍，置于倒置荧光显微镜下观察细胞体积。1.4.2心肌细胞蛋白质含量的测定 细胞接种于24孔板内，接种后调整细胞数每孔约为5×10 5个。各组细胞加药48 h后，吸去各孔的培养基，磷酸盐缓冲液清洗3遍，加入十二烷基硫酸钠( SDS)0.5ml溶解细胞，Lowry法测每孔细胞蛋白质含量。1.4.3 线粒体膜电位的检测 心肌细胞凋亡初的表现可通过线粒体跨膜电位的变化来检测，各组心肌细胞加药培养48 h后，弃掉板孑L内培养液，磷酸盐缓冲液清洗3次，加入1 ml JC-1染色工作液，于37 0C，5%C02培养箱中避光染色20 min，取出后用JC-1染色缓冲液冲洗2遍，置于倒置荧光显微镜下观察。JC-1在正常细胞线粒体内因浓度增高形成多聚体，而产生红色荧光;当细胞发生凋亡时，JC-1在线粒体内被释放以单聚体形式存在，而产生绿色荧光。

　　1.4.4Western blot方法检测蛋白表达

　　各组心肌细胞经药物处理作用48 h后，进行caspase-3蛋白测定。经BCA试剂盒测定蛋白质含量，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，PAGE中蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭。放人一抗中(1：2000)4℃杂交过夜。将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜经TBST冲洗3次后放人二抗(1：5000)孵育1～2 h。取出PVDF膜，TBST冲洗后，吸去多余液体，铺于玻璃板上。将ECL内的detection reagent1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1～2 min。放置到化学发光凝胶系统分析仪中进行ECI_化学发光，成像，分析。

　　1.4.5细胞内钙测定 各组心肌细胞经药物处理48 h后，磷酸盐缓冲液清洗3次，加入终浓度为5U_mol/L的Fluo-3/AM置于37℃，5%C02培养箱中继续培养45 min，然后吸出染液，再以磷酸盐缓冲液清洗3次，每孑L留下少量磷酸盐缓冲液。于细胞微孔板成像系统Cytation5观察细胞内与Ca2_结合的Fluo-3/AM显现的荧光情况。

　　1.4.6 免疫荧光法测定CaSR表达

　　爬片的细胞用磷酸盐缓冲液缓慢冲洗后，加入4%的冷的多聚甲醛固定20 min，之后磷酸盐缓冲液清洗3遍，0. 2% Triton-X 100通透10 min后磷酸盐缓冲液再次清洗3遍，血清封闭30 min，磷酸盐缓冲液冲洗后，一抗湿盒过夜，磷酸盐缓冲液冲洗后二抗室温孵育2h，荧光显微镜下观察。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS 17.O统计软件，采用单因素方差分析及LSD法进行统计学处理，计量数据均以x±s表示。

 　　2 结 果

　　2.1各组心肌细胞体积和蛋白含量 与对照组比较，ISO组心肌细胞蛋白含量明显增加(P<0.05);与ISO组比较，中、高剂量组及普萘洛尔组心肌细胞蛋白含量明显降低，差异有统计学意义(P<0. 05，PO. 05，表1)。鬼笔环肽染色显示，ISO组、低剂量组心肌细胞体积大于对照组，中、高剂量组心肌细胞体积与普萘洛尔相似(图1～6)。

　　表1各组心肌细胞蛋白含量的比较(肚g，x±s)

　　2.2各组细胞内线粒体跨膜电位的比较

　　对照组线粒体膜电位较高，表现为红色荧光较强;IS()组线粒体膜电位明显降低，表现为绿色荧光较强;与IS()组比较，低剂量组人参皂苷Rgl线粒体膜电位荧光变化不明显，中、高剂量组及普萘洛尔组线粒体膜电位明显升高，红色荧光增强。

　　2.3各组caspase-3表达的比较与对照组比较，

　　ISO组caspase-3蛋白表达明显升高;与ISO组比较，低剂量组caspase-3蛋白表达降低不明显，中、高剂量组及普萘洛尔组明显降低。

　　2.4各组心肌细胞CaSR表达的比较

　　免疫荧光法检查显示，对照组心肌细胞CaSR有少量表达，ISO组CaSR表达明显增加;与ISO组比较，低剂量组心肌细胞CaSR表达减少，中高剂量组和普萘洛尔组心肌细胞CaSR表达明显减少，荧光表达强度减弱。

　　2.5 各组心肌细胞内Caz+的表达Fluo-3/AM荧

　　光染色显示，与对照组比较，ISO组Ca2+荧光表达增强，低剂量组Ca2_有所减弱，中、高剂量组Ca2+能够明显降低，ISO诱导的细胞内钙荧光强度的增加。剂量组图24高剂量组图25普萘洛尔组 图20—25各组心肌细胞内Caz+的表达 Fluo-3/AM荧光染。

　　3讨论

　　心肌肥大是各种心血管疾病所共有的病理过程，可受多种因素及信号传导通路调控。心肌肥大初可表现为心肌细胞体积增大、心肌蛋白合成增加、心肌结构重构以及基因表达改变，即基因从胚胎时期重新表达。已知早期心肌肥大是心脏对应激的代偿性反应，但长期代偿性反应会引起心脏心室壁增厚、收缩功能障碍、心室扩张，从而进一步发展成各种类型的心脏病，如心肌梗死、心力衰竭，更甚者可能导致脑卒中和心脏猝死的发生。因此，找到一种预防和治疗心肌肥大的药物对治疗现阶段高危心血管疾病有重要意义。人参皂苷Rgl是人参主要活性成分，具有抗氧化、抗癌、心血管及神经保护作用口3。141。本研究发现，人参皂苷Rgl对ISO诱导H9C2心肌细胞肥大具有保护作用，并通过CaSR减轻ISO诱导的肥大心肌细胞凋亡。

　　CaSR是一种G蛋白偶联跨膜受体，能够维持机体Caz+离子稳态，并参与调节细胞凋亡、增殖分化及信号传导。现已证实CaSR在新生大鼠心室肌细胞、心肌组织、动脉血管平滑肌和内皮细胞中有功能性表达。在缺血缺氧条件下CaSR蛋白表达增加，并通过激活磷酸酯酶C、1，4，5一三磷酸肌醇通路引起内质网释放Ca2_，导致Ca2+离子增高;细胞内Ca2+超载和Ca2+稳态失衡是心肌肥厚和心力衰竭的始动因素，CaSR活性增强破坏细胞内Ca2_稳态，诱发线粒体应激引起心肌细胞凋亡。同时通过C-J un氨基末端激酶、p38丝裂原活化蛋白激酶途径增加冠状动脉粥样硬对心肌梗死的敏感性[19]。有研究发现，肺动脉高压大鼠模型中，在肺动脉血管平滑肌细胞外加入Ca2+可使Ca2+及CaSR表达显著增加，使用CaSR抑制剂可同时抑制并降低CaSR及Ca2'-的表达，利用RNA干扰技术抑制CaSR活性，能够显著降低细胞外Ca2+引起的细胞内Ca2+浓度增加，进而抑制肺动脉高压及右心室肥厚[20]。本研究中为了探讨人参皂苷Rgl对ISO诱导心肌细胞肥大保护作用的机制，选用凋亡

　　标志蛋白caspase-3和细胞内Ca2+变化来检测。普萘洛尔为|3受体阻滞剂，能够降低心肌的收缩性、自律性、传导性及兴奋性，并可减小急性心肌梗死的面积，抑制心肌细胞蛋白合成，重构左心室，减慢及缓解心肌肥厚的发展。因此，本实验选用普萘洛尔作为阳性对照，评价人参皂苷Rgl的干预作用，与ISO组进行比较。实验结果显示，ISO组以10vmol/L ISO诱导的心肌肥大模型心肌细胞体积、蛋白含量、线粒体膜电位、caspase-3蛋白、细胞内

　　CaSR和Ca2+浓度都明显增加，与ISO组比较，中、高剂量组及普萘洛尔组心肌细胞体积、蛋白含量、线粒体膜电位、caspase-3蛋白、细胞内CaSR和Ca2+ 浓度降低，表明中、高剂量人参皂苷Rgl及普萘洛尔均可抑制ISO引起的心肌细胞CaSR激活，对ISO诱导的心肌细胞肥大有保护作用。心肌细胞未用ISO处理前，人参皂苷Rgl的预处理不但可抑制ISO诱导的心肌细胞肥大、凋亡，还可降低细胞内CaSR表达，降低细胞内Ca2+浓度，说明人参苷Rgl对CaSR的调节与抑制细胞内Ca2+有关，以上研究结果提示，人参皂苷Rgl对ISO诱导的心肌细胞损伤的保护作用可能是通过抑制Ca2+/CaSR通路实现。

　　通过以上实验结果分析得出，人参皂苷Rgl可下调细胞内CaSR表达、降低细胞内Ca2+，对ISO诱导心肌细胞肥大有保护作用，其作用机制可能通过CaSR下调Ca2_、caspase-3表达有关，进一步明确了人参皂苷Rgl对心血管疾病的保护作用，为人参皂苷的开发成药及治疗心血管疾病提供更广阔的治疗方向与空间，但人参皂苷Rgl下调CaSR表达的作用机制尚未明确，需进一步深入探究。

　　[1] 梁飒 ,黄从新感受体与心 rfn管疾病 WJ研究进展 [J].疑难病杂志 , 2017, 16 ( 7) , 736-740. DOI: 10. 3969/j. issn. 1671-6450. 2017. 07. 024.

　　[2] Hu W,Jing P,Wang L,et al. The positive effects of ginsenaside Rgl upon the hematopoietic microenvironment in D-galactose-induced aged rat model[Jl. BMC Complement Altern Med, 2015, 15 : 119. DOI: 10. 1186/s12906-015-064