外周血单核细胞中组织蛋白酶表达与阿尔茨海默病发展的相关性研究

　　外周血单核细胞中组织蛋白酶表达与阿尔茨海默病发展的相关性研究

　　田力，师含，付开磊，滕伟禹

　　关键词：单核细胞;阿尔茨海默病;淀粉样B蛋白;组织蛋白酶类

　　阿尔茨海默病( AD)是痴呆常见的类型，在年龄≥60岁人群占各种类型痴呆的60%，其主要神经病理特征是细胞外存在大量由p淀粉样蛋白(Ap)高度聚集形成的老年斑、神经细胞内的神经原纤维缠结、神经元缺失以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性口3。脑内A(3的产生与清除失衡是AD发病的主要原因，且这一过程与免疫反应有关心。AJ3的沉积能活化脑内具有吞噬活性的小胶质细胞，引起先天性免疫应答，同时能吸引外周血单核细胞通过血脑屏障迁移人脑、发挥吞噬及蛋白降解的作用。AD患者单核细胞不能有效将Aj3内吞进入溶酶体、且不能进行有效降解，导致A8沉积、神经元死亡。本研究拟在外周血水平筛查与Al3降解代谢相关的基因，并初步探讨其功能。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　1.2 选择2012年1月～2017年12月于我院就诊并且年龄均≥60岁的AD、轻度认知障

　　碍( MCI)患者及健康老年人共78例，其中AD组者30例，男性14例，女性16例，平均年龄(68.6±6.5)岁;MCI组28例，男13，女15例，平均年龄(69.1±7.2)岁;健康老年人为对照组20例，男10例，女10例，平均年龄(66.1±8.0)岁。所有受试者自愿并签署本研究知情同意书。依据2014年AD国际诊断标准、2011年美国AD新诊断标准筛选AD及MCI患者。排除标准：局限性脑病、脑外伤、严重精神病、酒精或药物滥用者、伴有严重心、肝、肾、肺功能不全者、血液系统疾病、慢性结缔组织疾病、近6个月内接受过非甾类抗炎药或免疫治疗、恶性肿瘤。资料采集 研究对象入组后均由神经内科专业医师进行病史采集、神经系统体格检查，头颅CT或MRI检查、并进行简易智能状态检查量表、汉密尔顿焦虑量表、日常生活活动能力量表评估。

　　1.3确定目的基因 前期工作采集受试者外周血，Dynabeads CD14磁珠细胞分离，Trazol裂解后提取总RNA，委托Illumina基因公司进行基因芯片检测。基因表达谱结果筛选表达差异基因，筛选的标准为2组其中任何一组均为有效基因，且实验组与对照组相比较差异分值<-20或>20即为差异表达基因。从中选取与蛋白降解相关的组织蛋白酶(Cathepsin)B、D作为进一步研究的对象。

　　1.4 Cathepsin B和Cathepsin D mRNA表达水平检查 采用Taqman探针相对定量法，以甘油醛一3一磷酸脱氢酶(GAPDH)作为归一化Cathepsin B、D的持家基因。以构建的重组质粒为标准品，分别作系列稀释到10 - 9～10_1，根据扩增曲线和循环阈值，选取线性范围佳的稀释浓度做标准曲线，以质粒初始模板量的对数作横坐标、循环阈值作纵坐标。根据循环阈值求得每个标本的初始模板的绝对量。以“目的基因初始模板绝对量/(JAPDH初始模板绝对量”比值代表每个标本目的基因的mRNA表达水平的相对量。每个标本重复检测2次，取平均值。

　　1.5 Cathepsin B与Cathepsin D活性测定

　　分别采集3组外周血单核细胞，Cathepsin B、D活性试剂盒检测其活性。操作过程按说明书，以相对荧光单位表示蛋白酶活性。

　　1.6单核细胞对外源性Ap的降解

　　将3组单核细胞数调整为5×10 5，以10%胎牛血清RPMI-1640常规培养，加入均苯四甲酸(终浓度为111g/ml)诱导分化为巨噬细胞，混匀后放于C()：培养箱(37UC、5% COp)孵育过夜;24 h后换液，10%胎牛血清RPMI-1640;混匀后继续于C()，培养箱(37℃、5%CO，)孵育过夜;24 h后换液，加入l ml 10%胎牛血清RPMI-1640，加入Ap.一z(终浓度为2tlg/ml)。继续培养3h后换液去掉未被吞噬的A(3，开始计时，在oh、3h及6h时间点分别裂解细胞、收集蛋白，采用ELISA方法检测规定时间点单核细胞内吞的Al3.。：水平，以此来评价单核细胞的吞噬及降解能力。

　　1.7统计学方法采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组Cathepsin B和Cathepsin D表达的比较AD组Cathepsin B、D mRNA表达水平明显低于对照组和MCI组，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 各组Cathepsin B和Cathepsin D活性比较

　　AD组Cathepsin B、D活性明显低于对照组和MCI组(P<0.01)。MCI组Cathepsin B、D活性与对照组比较无差异(P>O. 05，图3～4)。

　　2.3 3组单核细胞内Ap水平比较

　　AD组单核细胞内A (31_12水平明显高于对照组和MCI组，差异有统计学意义(P<0.05)。MCI组单核细胞内水平与对照组比较：无统计学差异(P>0. 05)。

　　3讨论

　　AD是一种年龄相关的神经元退行性疾病，其中950/～990/为散发型、迟发性，但其病因、发病机制不清，尚无确切治疗方法。近年来大量的实验发现，免疫反应与AD的发病及进展相关，且对于A8清除能力的下降是疾病发生发展的主要原因7-8]。本研究前期研究发现，与正常老年对照者比较，AD患者单核细胞中与蛋白降解相关的蛋白酶表达下调，其中溶酶体酶Cathepsin B表达下调8.3倍，Cathepsin D表达下调4.2倍，因此本研究选择这2个基因进行下一步研究。

　　蛋白酶广泛存在于肝、脾、肾、骨、神经细胞、间质成纤维细胞、巨噬细胞等，以酶原的形式贮存在溶酶体。病理状态下，溶酶体膜稳定性降低、通透性增高，甚至破裂，大量蛋白酶释放到细胞质或组织间隙并被激活，介导细胞炎性坏死及发生凋亡，在许多疾病，如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、AD、多发性硬化症等的病理过程中发挥重要作用。

　　Cathepsin B、D定位于内体溶酶体系统，是蛋白酶家族的2个重要成员，有类似j3和7分泌酶活性。研究结果显示，Cathepsin B、D活性失调可能导致年龄相关的病理变化，包括自噬体的聚集以及脂褐质的形成均导致神经功能失调等损伤，同时细胞内未水解产物的不断聚集也增加了细胞的抗氧化压力口。有研究发现，Cathepsin B与A8的清除有关，Cathepsin B有助于AD模型小鼠脑内斑块的清除[13]。同时有研究证实，溶酶体酶在AD等神经退行性疾病发病过程中起重要作用。但Cathep-sin B、D在单核细胞中的表达情况及其与AD进展的关系尚未见文献报道。

　　实验表明，脑内固存的小胶质细胞虽然能够吞噬并将A(3运输到内体溶酶体系统，但是却不能有效地降解脑内的Al3，而由单核细胞迁移人脑后分化成的骨髓源性小胶质细胞能有效地清除脑内沉积的A口，并在限制AD模型小鼠A(3沉积的过程中发挥重要作用r3,5]。这提示，外周血免疫系统中单核细胞参与了AD的病理过程，AD患者的单核细胞对于A8的吞噬功能下调在疾病进程中起关键作用。我们已在前期实验中，通过基本芯片筛查发现，Cathepsin B、D表达下调。本研究结果显示，AD组Cathepsin B、D mRNA表达水平与活性明显低于对照组和MCI组，而单核细胞内AJ3，。z水平明显高于对照组和MCI组，提示AD组外周血单核细胞中Cathepsin B、D活性下降，且直接影响了对于外源性的降解。

　　总之，AD患者外周血单核细胞CathepsinB、D表达下调与A(31。：的降解的有关;虽然目前我们的结果还不能直接将。Cathepsin B、D表达及活性变化与AD病情发生、发展相关联，但由于外周血生物标本相对容易采集得到，如果可以根据AD患者及对照者外周血单核细胞之间Cathepsin B、D表达差异作为疾病诊断的标志之一，并以此进行相关基因治疗方面的研究具有潜在的临床意义。MCI虽然并不是AD的一种病理类型，但发展为AD的比例较正常老年人明显增高，所以被认为是AD的临床前期阶段。本研究结果发现，MCI组单核细胞中Cathepsin B、D表达、活性及对于的降解能力与对照组比较无统计学意义。考虑与病情发展程度及样本量不足有关，下一步拟继续扩大样本量进行深入研究，同时考虑增加MCI组基因芯片的筛查。

　　本研究是在基因芯片基础上进行分析筛选，选取与A(3降解有关的的候选基因，体外实验验证其表达及活性与Al3.。。降解能力的关系，从而明确Cathepsin B、D表达异常在AD发病机制的作用，以期在外周血水平寻找到一个可以预判疾病发展的生物学指标，为AD的临床治疗确定靶标。下一步研究拟采用基因调控方法深入探讨单核细胞中Cathep-sin B、D表达与AD动物脑内A(3形成的关系，在基因水平对AD的病理机制进行研究。