p53相关长链非编码RNA及其与口腔癌的关系

　　p53相关长链非编码RNA及其与口腔癌的关系

　　韩瞳瞳 陈乔尔 朱友明

　　安徽医科大学口腔医学院合肥230032

　　[摘要] p53基因是细胞生长的负性调节因子，正常情况下通过调控细胞的增殖和凋亡发挥抑癌作用，p53突变常导致肿瘤的发生。近年研究发现，长链非编码RNA( IncRNA)在多种肿瘤的发生发展中起到重要作用。本文将对p53相关的IncRNA在口腔癌中的研究进展进行论述，旨在为口腔癌患者的治疗提供新策略。

　　(关键词] p53;长链非编码RNA;肿瘤;口腔癌

　　[中图分类号] R 782 [文献标志码】A 【doi] 10.7518/gjkq.2018.05.017

　　Long non-coding RNA associated with p53 and the relationship with tumor Han Tongtong, Chen Qiaoer, Zhu Youming. (School of Stomatology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China)

　　[Abstract] p53 gene is a negative regulator of cell growth which can suppress the tumor through the regulation of cell proliferation and apoptosis under normal circumstances. The mutation of p53 0ften lead to the tumorigenesis. Recently,

　　Long non-coding RNA (lncRNA) was identified as having a function role in the tumorigenesis and development of a variety oftumors. The review aimed to discuss the relationship of LncRNA which associated with p53 and oral cancer, and provide new strategies for patients with oral cancer.

　　[Key words] p53; long non-coding RNA; tumors; oralcancer

　　口腔鳞状细胞癌( oral squamous cell carcino-ma.OSCC)占口腔癌80%以上[1]，其中以舌鳞状细胞癌( tongue squamous cell carcinoma，TSCC)常见，由于传统治疗效果多不理想，近年来基因治疗应运而生。p53调控异常与多种肿瘤的发生发展密切相关，而长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)因其在致癌和抑癌过程中的重要作用日渐成为研究热点。阐明p53及Lnc-RNA与口腔癌的关系，有助于明确OSCC的发生机制，寻找新的治疗方法。

　　1 p53概述

　　抑癌基因p53突变是常见的癌症相关基因改变之-[2]。人类p53基因定位于第1 7号染色体的短臂上，正常情况下编码产物是野生型P53蛋白。野生型P53蛋白是一种DNA结合蛋白，在Gl/S期交界处发挥检查点的作用，一旦发现DNA损伤、缺陷，P53蛋白就会使细胞停滞在Gl、G2期，抑制细胞增殖，修复损伤DNA。如果修复失败，P53蛋白就会启动细胞凋亡机制，诱导携带错误遗传信息的细胞凋亡，防止演变为癌细胞。若p53基因突变，则对细胞的异常增生和恶性转化起到促进作用㈣。已有研究[a]证明，p53参与多种抑制异常细胞增殖的信号转导过程，若p53长期沉默可能导致肿瘤的发生，而p53重新活化可以抑制肿瘤生长。

　　2 IncRNA概述

　　长期受到关注的人类基因组中的蛋白编码基因，其实仅占总基因的2%，而超过90%的转录产物削E编码RNA( non-coding RNA, ncRNA)[5]。根据ncRNA的长度将其分为3类：短链、中链、IncRNA。其中，IncRNA是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，缺乏蛋白编码功能，在真核生物中普遍被转录。新近研究[5-8]表明，IncRNA主要通过染色质修饰、甲基化、转录沉默或转录活化等方式，在表观遗传学、转录及转录后水平等层面调控基因表达。在乳腺癌、非小细胞型肺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等肿瘤中均发现了IncRNA表达失调，提7JxlncRNA参与了肿瘤的发生发展[9—11]。

　　3 p53相关IncRNA与肿瘤的关系

　　鉴于p53及IncRNA和肿瘤之间的密切联系，许多研究着眼于此，大量体内外试验证实了p53和某些IncRNA的强相关性，均发现，多种IncRNA作为“p53调节子”或“p53效应器”参与p53信号通路，进而调控肿瘤生长，如H19、lincRNA-RORMEG3、TUG1、lincRNA-p21、lincpint等[1 2]。一方面，p53诱导促进部分IncRNA的生成，另一方面，IncRNA合成后可以参与p53通路并调控p53表达，影响肿瘤的进展。

　　3.1 IncRNA H19

　　IncRNA H19位于人类染色体llp15.5，全长2.3 kb。H19是一个高度保守的具有印迹特征的基因，与人类胰岛素生长因子2基因是一对相邻近的父系表达生长因子。p53诱导IncRNA H19合成，而合成后的H19与p53结合抑制p53活性，降低p53下游靶基因凋亡相关因子Bax的水平，从而促进癌细胞的增殖并抑制凋亡[13]。Adriaenssens等[14]发现，IncRNA H19在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，H19高表达与TNM分期的T值和荷尔蒙受体(雌激素和孕酮受体)存在显著正相关，该研究还发现H19启动子部位受野生型p53蛋白下调。Yang等[1 s]将荧光素酶报告基因标记的p53质粒和H19共转染胃癌细胞系AGS，结果发现p53活动显著减弱，由此证实了H19能够抑制p53蛋白的表达活性;该研究还发现IncRNA H19在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达上调，体外H19的过表达能够促进细胞生长，反之则抑制细胞活性。Liu等[.s]通过Meta分析研究了关于9种实性肿瘤中H19的表达情况，结果发现，H19高表达者整体生存期短，肿瘤分化差，淋巴结转移更多见，临床分期更高。由此可见，IncRNA H19可以作为某些肿瘤诊断、预后和临床病理的生物标志物。

　　3.2 HOX反义基因间RNA

　　HOX反义基因间RNA( HOX transcript anti-sense intergenic RNA，HOTAIR)是早被发现的参与肿瘤发生、发展的IncRNA之一，长约2 1 58个核苷酸，由染色体12q13.13上的HOXC基因座转录。但敲低HOTAIR的表达并不影响HOXC基因座的表达活性，而是通过招募多梳抑制复合物2( poly-comb repressive complex 2，PRC2)并调控EZH2(PRC2的一个亚基)染色体占位，使远端HOXD基因座组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(histone H3lysine 27 trimethylation，H3K27me3)，从而抑制HOXD位点一段长约40 kb的基因转录[17-18]。Zhai等[a]检测48例非小细胞型肺癌标本中HOTAIR的表达水平，发现其在癌组织中的表达较癌旁正常组织普遍偏高。肺癌细胞系NCI-H157(含突变型p53)和H1299(p53丢失)的HOTAIR水平均高于A549(含野生型p53)，这说明HOTAIR的表达水平和p53的功能性呈负相关关系。通过计算机信息预测发现，HOTAIR启动子部位有2个p53结合位点，p53可以直接结合HOTAIR启动子区域以抑制其表达。染色质免疫沉淀实验显示，HOTAlR过表达能提高p53启动子区域H3K27me3的水平，抑制p53表达。这一系列试验说明，肺癌中p53和HOTAIR之间存在负调控，二者表达呈负相关，并证实p53上调抑制了肺癌细胞的增殖、迁移能力。Liu等[t-]

　　检测发现，在HOTAIR被敲低后，胃癌细胞上皮标志物的CDH1水平升高，间质标志物水平下降，提示了其上皮.间质转化( epithelial to mesen-chymal transition，EMT)过程受到了抑制，而EMT是癌细胞获得侵袭转移能力的有效方式之一，说明HOTAIR通过诱导EMT，进而促进了胃癌细胞的转移。MiR34a在胃癌组织中下调，与HOTAIR的表达负相关，进一步证实HOTAIR是通过募集PRC2复合体直接结合至miR34a的启动子区域，改变其H3K27me3状态使miR34a沉默，从而促进胃癌转移。

　　3.3 MEG3

　　母系表达基因MEG3(maternally expressed gene 3)是一种长度大于1.6 kb，定位于染色体位点14q32的印迹基因。一般情况下，IncRNAMEG3在正常组织中表达，但在人多种肿瘤中表达丧失或显著下调，可能扮演“抑癌基因”的角色。上调胰腺癌细胞系PANC-1中MEG3表达，结果使p53的表达增加了2.5倍，细胞增殖受到抑制。敲低MEG3表达后，p53表达也随之下调，PANC-1细胞存活率增加，凋亡减少，说明PANC-1细胞的凋亡是由MEG3和p53介导，且MEG3通过抑制p53的降解以控制p53的表达[z 0]。Zhu等f2.】在肝细胞癌标本中也检测到了IncRNA MEG3下调，上调MEG3表达能抑制肝癌细胞增殖。该试验还证实肝癌细胞中MEG3是通过与p53蛋白结合，活化了p53介导的转录活动，进而影响了部分p53靶基因的表达。Zhang等『22]在子宫颈癌中证实了MEG3的低表达与MEG3肩动子甲基化水平正相关，在子宫颈癌中MEG3启动子部位超甲基化，而去甲基化能使MEG3表达恢复至正常水平。MEG3表达较低者，淋巴结转移率高，生存期较短，指出MEG3可作为判断淋巴结有无转移的生物标志物。Chen等[∞]通过MTT法和裸鼠移植瘤试验分别证实了MEG3过表达能抑制体外和体内肝癌细胞的生长。Westernblot检测示，MEG3过表达不仅增加了内质网上未折叠蛋白反应的3种关键蛋白(肌醇必需酶1、蛋白激酶R样内质网激酶j活化转录因子6)的表达量，而且使p53表达增加，并进一步证明MEG3上调通过蛋白激酶R样内质网激酶/磷酸化真核细胞起始因子2a/核因子-KB通路活化p53而诱导肝癌细胞HepG2的凋亡。

　　3.4 Linc-ROR

　　Linc-ROR定位于染色体18q21.31，长约2.6 kb，初是在诱导的多潜能干细胞中被发现。Hou等[∞]发现，乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中Linc-ROR高表达，上调乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MC-FlOA中Linc-ROR的表达水平，促进了2种细胞的EMT过程。Linc-ROR过表达可以促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，裸鼠皮下成瘤提示，Linc-ROR会促进体内乳腺癌的发生和转移，并证明Linc-ROR作为miR-205的“分子海绵”，推测Linc-ROR阻止miR-205靶基因ZEB1和ZEB2的降解来调控上皮一间质转化过程，参与肿瘤进展。Zhan等[24]也证实，Linc-ROR在体外均能促进胰腺癌细胞的生长，并证实Linc-ROR通过抑制p53表达，活化ZEB1使其表达上调，诱导EMT来介导胰腺癌细胞的侵袭和转移。此外，Chen等[筋]研究还发现，敲低乳腺癌细胞中Linc-ROR的表达，细胞对5.氟尿嘧啶和紫杉醇的药敏性提高，并证实Linc-ROR上调是乳腺癌细胞侵袭和产生耐药性的重要原因。有研究发现，细胞内上皮型钙黏附蛋白表达增加，而间质细胞标志物波形蛋白和神经型钙黏附蛋白表达降低，侵袭能力降低，证实Linc-ROR敲低抑制了肿瘤的EMT。

　　3.5人肺腺癌转移相关转录因子1

　　人肺腺癌转移相关转录因子( metastasis asso-ciated lung adenocarcmoma transcript, MALAT)-1受p53调控，长约8.7 kb，定位于染色体llq13，在哺乳动物体内高度保守。Chen等[26]研究发现，肾细胞癌组织和肾癌细胞系中IncRNA MALAT-1和凋亡抑制蛋白Livin均为高表达，敲低MALAT-1表达能使癌细胞凋亡增加，细胞活性降低。染色质

　　免疫沉淀试验和pulldown实验进一步表明，MALAT-1通过直接特异性结合Livin蛋白增强其稳定性，调Livin蛋白的表达，能够促进癌细胞的增殖和转移。Huang等[27]发现，甲状腺癌组织中MALAT-1和参与细胞功能调节的一种骨架蛋白IQGAP1表达上调，沉默MALAT-1显著降低TIQGAP1启动子部位组蛋白的乙酰化水平，抑制IQGAP1的表达，并抑制了细胞的增殖和侵袭，表明MALAT-1是通过调控IQGAP1的表达促进癌发生、发展。Yao等[281证实，食管癌中也存在MALAT-1的过表达，沉默MALAT-1表达能够显著抑制食管癌细胞的生长、迁移和侵袭，并诱导细胞阻滞在G2/M期，促进细胞凋亡。胰腺癌组织中IncRNA MALAT-1和PRC2的亚基EZH2的表达呈正相关[2 9]，而MALAT-1与上皮型钙黏附蛋白之间呈负相关。在胰腺癌组织中EZH2表现为上调，体外敲低EZH2，能够抑制癌细胞的迁移和侵袭，但是并未影响细胞增殖。另外MALAT-1能通过与EZH2物理性结合，将EZH2召集至上皮型钙黏附蛋白的启动子部位抑制其表达，从而有助于癌细胞的侵袭和转移。此外有研究[30]发现，在30例子宫颈癌组织中，80%患者的MALAT-1表达上调，且MALAT-1的水平与淋巴结转移、肿瘤分化、临床分期之间密切相关，推测MALAT-1可能作为子宫颈癌的预后标志物，下调MALAT-1，可能阻止子宫颈癌的进展。4 p53相关IncRNA与口腔癌的关系 近年研究发现，口腔癌中也存在一些p53相关IncRNA的异常表达，并且与口腔癌的发生发展及预后有关。Chang等[31]发现，在Tca8113和SCC-25等OSCC细胞中LncRNA MALAT-1的含量明显高于正常人口腔细胞，构建慢病毒载体LV-shMALAT-1敲减OSCC细胞中MALAT-1表达，能抑制细胞活性、集落形成，诱导细胞凋亡，体内试验显示裸鼠移植瘤生长受抑制，反之促进OSCC生长。同时发现miR-125b和MALAT-1之间存在结合位点，且miR-125b可以负性调节信号传导及转录激活因子3( signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)，推测MALAT-1可能作为竞争性内源RNA通过miR-125b/STAT3途径促进OSCC进展。Zhou等[32]发现，在OSCC组织中MALAT-1高表达与患者预后差、生存率低有关，体外细胞研究提示，siRNA下调MALAT-1后OSCC细胞迁移、侵袭能力显著降低，同时伴随基质金属蛋白酶2、9减少。此外，下调MALAT-1能使上皮型钙黏附蛋白水平升高，而神经型钙黏附蛋白、波形蛋白下降，说明EMT过程受阻，进一步试验发现，OSCC中MALAT-1是通过调控核因子KB和B一连环蛋白的核转位来影响信号通路的活化及EMT过程的，从而促进了肿瘤的生长。Zhang等[，3]对TSCC进行研究，与正常口腔组织相比后发现，TSCC中MALAT-1上调，体外TSCC细胞研究发现miR-124可以与MALAT-1直接结合并促进TSCC的生长、侵袭及转移。此外，MALAT-1能通过作用于Notch信号通路上重要的细胞表面受体JAG1来调控TSCC生长，所以认为MALAT-l/miR-124/JAGl在TSCC中发挥重要作用。Fang等[34]检测了1 27例TSCC组织标本，证实MALAT-1高表达与淋巴结转移正相关，敲低MALAT-1的表达能够抑制TSCC细胞的增殖和迁移，同时检测到一些富含脯氨酸的小分子蛋白( small proline rich protein, SPRR)表达上调，并推测MALAT-1高表达使小分子蛋白SPRR2A的水平下调而促进TSCC的远处转移。检测了76例OSCC组织样本，与正常口腔组织相比后发现，LncRNA HOTAIR表达显著增加，并且与OSCC临床分期、淋巴结转移、病理分级、患者生存率密切相关。siRNA敲低HOTAIR后，OSCC细胞生长及迁移、侵袭能力明显受抑制，流式细胞术提示细胞凋亡增多，同时检测到上皮型钙黏附蛋白在转录和翻译水平上表达均增加。进一步试验证实HOTAIR通过结合PRC2复合体亚基EZH2和调节上皮型钙黏附蛋白启动子部位组蛋白H3K27me3来促进EMT过程及OSCC进展的，因而推断HOTAIR与OSCC的发生及转移密切相关，其有可能成为判断OSCC患者预后的肿瘤标志物。Liu等[36]应用多柔比星(doxorubicin.DOX)诱导TSCC细胞Tca8113的DNA损伤，发现细胞中HOTAIR和p53表达均上调。抑制Tca8113中p53的表达，会影响DOX对HOTAIR的上调作用，这说明DOX诱导HOTAIR的表达与p53有关。敲低HO-TAIR的表达抑制了Tca8113细胞的活性，流式细胞检测显示，处于G2/M期的细胞比例增加，而S期的细胞比例下降，表明HOTAIR的下调是通过改变细胞周期来抑制细胞增殖的。将HOTAIR敲低的Tca8113细胞再经DOX处理，其细胞凋亡显著增加，说明DOX通过升高HOTAIR的表达，进而抑制细胞凋亡。Jia等[37]检测到TSCC组织和TSCC细胞系SCC-25、CAL-27中LncRNA MEG3和miR-26a普遍低表达，二者表达呈正相关，并证明miR-26a能作用于DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase 3B.DNMT3B)mRNA的3'UTR抑制其表达，进而使MEG3上调。体外细胞试验通过构建表达载体pc-DNA3.1-MEG3发现，MEG3过表达可以抑制TSCC细胞活性，使Gl期细胞增多，促进细胞凋亡，并指出MEG3经活化p53介导来发挥抑癌作用。由上可知，MEG3可作为TSCC独立的预后指标，低表达预示着患者生存期短、预后差。Liu等利用过表达载体和siRNA技术分别上调和敲减OSCC细胞中MEG3表达，并检测到WNT信号通路上B.连环蛋白表达量与MEG3负相关，由此推测MEG3通过负调控WNT/p-连环蛋白信号通路来抑制细胞生长、迁移，且证实MEG3的表达水平与DNA甲基化程度有关。发现，LncRNA H19的表达量在TSCC组织中存在明显上调，且H19表达水平与肿瘤分级、淋巴结转移、预后有关，相对低表达的患者生存时间更久。shRNA敲低TSCC细胞中H19，结果提示下游的p一连环蛋白和糖原合成酶激酶-3p的活化受阻，同时细胞周期蛋白Dl和癌基因c-Myc活化也受到抑制，上皮型钙黏附蛋白和ZO-1上调，而神经型钙黏附蛋白和波形蛋白下调，提示EMT进程被抑制。裸鼠移植瘤模型研究显示，H19敲低抑制了体内TSCC的生长及肺部转移。进一步研究证明，H19通过与EZH2结合影响了B一连环蛋白/糖原合成酶激酶一3 p/EMT信号通路。Linc-ROR在OSCC组织中的表达也出现了上调，尤其在疗效差和肿瘤复发的OSCC患者中，其上调更为显著。在OSCC细胞中，过表达Linc-ROR使miR-145-SP水平减低，并且Linc-ROR通过结合miR-145-5P致使下游调节细胞分化的4种核心转录因子的表达上调，同时检测到上游调控基因p53的下调。

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