晟斯医学 - 医学科研学术知识和资源共享网站
当前位置:首页 > 医学资讯 > 正文

染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, CHIP)

作者:小笔 时间:2018.10.29 来源:Freescience联盟

发送实验到本公众号(Freescience联盟)后台,查看更多实验相关推文(◍•ᴗ•◍)


真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境中的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径,而染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技术是目前公认的研究此相互作用的最佳选择,是真核生物基因表达机制研究中不可或缺的核心技术之一。


它的基本原理是在活细胞状态下,固定蛋白质-DNA(染色质)复合物,并将其切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法(抗体亲和)沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片段的纯化与后期检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。


本次小笔想要介绍的方法,主要基于Nature Protocols, Vol.1 No.1, 2006的方法介绍,再结合自己的感悟体会,总结哒,希望对大家有所帮助哦~


——Nature protocol,2006

染色体免疫共沉淀(ChIP)是可在体内用来确定与某一特定蛋白结合所在的特异性DNA序列的技术。具体操作如下:

交联和细胞收集
1.  每1 mL培养基添加37%(wt/vol)甲醛40 μL,使得甲醛的终浓度为1.42%,室温孵育15 min。
备注:交联的时间和甲醛的浓度能够影响核染色质断裂的效率。缩短交联时间(5-10 min),采用稍低的甲醛浓度(1%)均能提升核染色质断裂的效率。很多实验中会采用孵育10 min,甲醛1%来提高效率。
2.  终止交联:采用甘氨酸(125 mM)室温作用5 min。
3.  细胞刮刀收集细胞,2000 g,5 min,4℃离心,随后用预冷的PBS清洗细胞2次。
如果时间不够,在完成这步后可以将细胞沉淀储存于-80℃,等有空的时候继续哦


细胞裂解和超声破碎
4.  向细胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制剂的IP buffer(一个10 cm直径的皿的细胞加入1 mL 的IP buffer),重悬。
5.  超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。(最佳的DNA片段的长度为0.5-1 kb)。
6.  超声破碎结束后,12 000 g 4℃离心10 min。留上清200 μL,取一部分用于接下来的实验,其他可保存于-80℃备用,可保持几个月没问题的。


免疫沉淀反应
7.  200 μL中,100 μL加抗体做为实验组;100 μL不加抗体做为对照组。
8.  在100 μL的超声破碎产物中,加入900 μL ChIP Dilution Buffer和20 μL的50×PIC。再各加入60 μLProtein A-agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。
9.  1 h后,在4℃静置10 min,700 rpm离心1 min。
10.  吸取上清。各自留取20 μL做为input。一管中加入1 μL抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

免疫复合物的沉淀及洗涤
11.  孵育过夜后,每管中加入60 μL Protein A-agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。
12.  4℃静置10 min,700 rpm离心1 min。去除上清。
13.  依次用下列溶液清洗。洗涤溶液:(1)low salt wash buffer-1次;(2)high salt wash buffer-1次;(3)LiCl wash buffer-1次;(4)TE buffer-2次。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。
14.  清洗完毕后洗脱。洗脱液的配方:100 μL 10%SDS,100 μL 1M NaHCO3,800 μL ddH2O,共1 mL。每管加入250 μL洗脱buffer,室温下颠转12 min,静置离心后,收集上清。重复一次。最终的洗脱液为每管500 μL。
15.  每管加入20 μL 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)混匀,65℃解交联过夜。


DNA样品的回收
16.  解交联结束后,每管加入1 μL RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。
17.  每管加入10 μL 0.5 M EDTA,20 μL 1M Tris.HCl(PH6.5),2 μL 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。
18.  DNA片段的回收。最终的样品溶于100 μL ddH2O。


PCR分析等,均会影响其酶切的效率。


相关推送:

Western百败百战老学姐的心酸笔记

细胞培养----初恋时我们也懂爱情

实验技术:Real time PCR

RT-PCR技术相关曲线解读

实验技术:免疫学常用技术之----免疫组化(石蜡切片/冰冻切片)

答疑解惑之免疫组化

质粒DNA提取实验

生物实验的基本原理(Y叔分享的实验心得)

影响实验精确度的RNA分析套路及优化

组织切片的数据统计怎么做

质粒构建:从入门到精通之初窥门径

质粒构建:从入门到精通之上下求索

质粒构建:从入门到精通之高手进阶

RT-qPCR不想自己设计引物?送你一个现成的数据库要不要?!

点 这里 看R界传奇老司机直播录像

freescience联盟QQ交流群: 321950419

(点 这里 和 这里 认识我们哦~)

长按以上二维码留言“实验”进实验微信交流群

点 这里 查看sci文章润色服务

 这里 领我们整理的软件库

点 这里 进免费免安装的文献下载神器

点本文左下角的 阅读原文,手机端可关键词检索历史推送资料

旗下网站

晟斯医学- 临床医生学术科研发展平台 2014-2019 晟斯医学版权所有
Copyright © 2014-2019 晟斯医学 All Rights Reserved. 备案号:苏ICP备11037034号-5 版权所有:南京孜文信息咨询有限公司