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SIRT7通过调控SP7/Osterix的赖氨酸乙酰化在骨形成中起作用的机制研究 | 文献精读

作者:谢丹涛/秦安 时间:2018.10.29 来源:Freescience联盟

作者:谢丹涛/秦安

来源:科研小助手


摘要:

SP7/Osterix(OSX)是一种调控成骨细胞分化过程中多种相关基因的转录因子。然而,翻译后修饰对其转录活性的影响至今还不清晰。在这里,我们研究报告,sirtuins,一类 NAD(+)依赖的去乙酰化酶,通过调节赖氨酸的去乙酰化而影响OSX的转录活性。


Sirt7基因敲除小鼠会出现严重的骨质疏松表型,其特征是骨形成减少和破骨细胞增多。同样的,成骨细胞特定的Sirt7基因敲除小鼠也出现相似的表型。OSX与SIRT7的相互作用导致OSX的活性增高而不改变其蛋白质表达。


SIRT7可以通过使OSX C-末端第368位赖氨酸(K)的去乙酰化,从而促进其N-末端的转录活性。另外,sirt7介导的K368的去乙酰化促进SIRT1的OSX去丙酰化作用,从而增加OSX的转录活性。


综上,我们的研究结果表明,SIRT7通过调节OSX的去乙酰化,在骨的形成过程中起着至关重要的作用。

介绍:

骨是一种多功能组织,除了它的最基本功能:构建身体的框架,还参与造血(干细胞)、代谢(矿化和能量代谢)、再生和大脑(发育,认知和行为)功能。两种联系紧密的细胞——负责骨形成的成骨细胞和骨吸收的破骨细胞,调节骨重塑过程。


这两种细胞之间失衡的话,容易导致骨质疏松,增加了骨折的风险。骨质疏松症是骨相关疾病中最常见的,全球估计有200多万患有骨质疏松。Runt-related transcription factor 2(RUNX2)和SP7/Osterix(OSX)这两个转录因子,是已经被证实的对成骨细胞的分化是至关重要的。在Runx2敲除(KO)或Osx KO 小鼠中,软骨内成骨和膜内成骨均不会发生。


Sirtuins(一种依赖NAD(+)的去乙酰化酶),在哺乳动物中有(SIRT1-7)7种存在形式,近年来的研究发现,除了去乙酰化,该酶还有去其他酰基化,如丙酰化、琥珀酰化、丙二酰化、十四酰化、十六烷酰化。


其中,SIRT1、6、7主要位于核内,它们通过对特定基因的组蛋白和转录因子的乙酰化/去乙酰化来调节其表达。在这里我们运用了多种方法,包括Sirt7 KO老鼠、成骨细胞中特异性敲除Sirt7小鼠、细胞实验,来研究SIRT7在骨骼中的作用。


研究结果显示SIRT7通过调节OSX C-末端第368位赖氨酸(K)的去乙酰化来使,从而促进其N-末端的转录活性,最终促进骨的形成。

结果:

1.Sirt7 KO 小鼠出现了严重的骨质疏松。
从Sirt1 or 6 不足的小鼠均出现低骨量表型(骨形成↓),猜测,Sirt7 是否也有类似情况?于是作者构建Sirt7 KO 小鼠。

Fig.1a:microCT 示KO小鼠(14-15周)股骨的骨量↓;Fig.1b-d:是a的量化:b(皮质骨面积)、c(皮层面积分数,即皮质骨面积/总截面积)、d(皮质骨厚度)↓;Fig.1e:mean eccentricity,平均离心率↑(离心率e,0<e<1, 图像为椭圆,越接近0代表图形越圆,这里离心率↑说明椭圆形的股骨形状的改变);


以上数据说明,股骨骨皮质受到了影响。接下来作者探究了骨小梁的变化。


Fig.1f-h:a的量化:f(BV/TV体积)、g(Tb.Th厚度)、h(Tb.N数量)↓;Fig.1i:骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,TBPf),是指骨小梁凸面和凹面的程度,单位是1/mm。降低时提示骨小梁由杆状向板状变化,发生骨质疏松时TBPf值增加。说明KO鼠出现了骨质疏松表型;


Fig.1j:Sirt7 KO 小鼠符合遗传规律;
Fig.1k 生后2月的死亡率,i体重接近,m血清钙磷水平,均无统计学意义;
提示KO小鼠的骨量减少,并不是因为KO比WT早成熟或者是KO的钙磷代谢紊乱。


SFig.1a-h:15-16w雄鼠已经出现了肉眼可识别的骨量减少;

SFig.1i-l: 15d雌鼠已出现相似的表型;

除了股骨,作者还研究了第4腰椎L4的变化。
Fig.2,14-15w雌鼠,a microCT 示KO鼠的BV/TV↓ 及a的量化:b(MAR矿化率),c(BFR/TV骨形成率),d(N.Ob/T.Ar成熟成骨细胞数量)↓;Fig.2e:成骨相关基因(Alp,Col1a1,Ocn, Osx,,Runx2)↓;

SFig.1m:与骨表型一致,出生后不久的小鼠(15d雌鼠)的mRNA也是同样的趋势,虽然没有统计学意义;

SFig.1n-p:14-15w 雌鼠L4,n(Oc.S/BS),o(N.Oc/ B.Pm),p(TRAP染色)↑;
提示:SIRT7也能调节破骨细胞的生成。

SFig.1q:12w和2y的老鼠相比,老年鼠的成骨相关基因↓;
Fig.2f:老年鼠的Sirt6、7↓;
提示:这两个sirtuins(去乙酰化酶)可能参与了老年鼠骨头的退化。


2. SIRT7正向调节成骨细胞分化
为了证明在成骨细胞中的SIRT7的作用,作者开始了细胞实验:

Fig.3a:收集KO、WT小鼠的颅盖骨的成骨细胞,培养10天,用茜素红对矿化结节进行染色;Fig.3b:对收集的成骨细胞进行 直接计数(左)和 WST-1比色度试验(右,与MTT法类似);


结合3a、3b来看尽管细胞的增值并没有受多大的影响,但是KO小鼠的成骨细胞的矿化明显地比WT的下降了。接下来,作者又用了成骨细胞系MC3T3-E1细胞来研究SIRT7在成骨细胞前体向成熟成骨细胞分化过程中的作用。


Fig.3c:已分化的MC3T3-E1细胞较未分化的,SIRT1、6、7均明显少了,提示SIRT7是在早期的分化阶段起着作用;


Fig.3d:构建knowdown(KD)Sirt7的MC3T3-E1细胞,Wb验证KO效果;
Fig.3e-f: KD的MC3T3-E1细胞,在诱导分化培养基中培养30天后,矿化明显受损;

之前的组织形态学分析提示SIRT7也能影响破骨细胞的生成,因此,作者也对此做了细胞实验。


SFig.2a-c)分离 KO、WT的骨髓来源的粒/巨噬细胞前体,用M-CSF和RANKL刺激;
SFig.2d-f)构建Sirt7 KO  RAW264.7细胞,用M-CSF和RANKL刺激;


遗憾的是,SFig.a/d TRAP染色无明显差异,SFig.b/e 破骨细胞数及SFig.c/f 破骨相关的基因的表达无明显差异。提示:破骨细胞的SIRT7对其分化,并不是必不可少的。猜想:之前看到的破骨增加,是因为成骨细胞中的SIRT7的不足影响了成骨细胞,继而导致破骨细胞的变化?于是作者做了一个细胞共培养实验:用sirt7 KO 和WT 小鼠颅盖骨中分离的成骨细胞分别和WT的脾脏细胞(脾脏中也含有粒细胞/巨噬细胞前体)共培养:


遗憾的是:SFig.2gTRAP染色无明显差异,SFig.2h破骨细胞数及SFig.2i破骨相关的基因的表达无明显差异, SFig.2j 成骨细胞分泌的RANKL和Opg也没有统计学意义。自此,作者再也没有办法解释之前组织形态学看到的破骨增多的现象,下文也没有再对这方面做出详述,从此成为未解之谜。

3.成骨细胞中特定的SIRT7,在成骨中扮演着重要角色。
有了全身敲,作者又构建了成骨细胞特异性条件敲除Sirt7的小鼠,



得到与之前一样的结论。到这里,都是在讲表型:SIRT7正向调节成骨细胞的分化和功能。接下来开始讲机制。

4.SIRT7与OSX相互作用,调节其转录活性。
因为RUNX2、OSX是已经被证实在成骨细胞的分化过程中扮演着重要角色,所以作者想探究SIRT7对两种转录因子转录活性的影响,在此,作者运用了荧光素酶报告基因实验。简要了解一下:


转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。


其原理简述如下:
(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒。
(2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
(3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
再言简意赅些:就是把OSX的靶启动子的特定片段与GAL4DBD结合在一起,构成GAL4-OSX,再用一个能与GAL4DBD结合的荧光酶基因来检测,从而通过荧光强度来侧面反映OSX转录因子的活性。


Fig.5a:Sirt7 KO 的成骨细胞里,OSX的转录活性↓;
SFig.3a:相反,RUNX2的转录活性并没有明显改变;


Fig.5b在用siRNA使Sirt7减少的MC3T3-E1细胞中,右图,构建质粒时,插入的是Col1a1与OSX结合的特定基因,提示,Sirt的沉默会使OSX对Col1a1的转录活性降低,如果补充OSX可以逆转这种趋势。这些结果都证明了Sirt在成骨细胞中,可以增加OSX的转录活性。

有报道:OSX可作为一个转录激活因子,转录激活 Dlx 基因,在成骨细胞的发育中起到重要的作用,于是作者也同样构建了OSX结合于Dlx5的质粒。


SFig.3b: siRNA并未对其造成显著影响,提示SIRT7影响成骨并不是走的这一条通路。

已经证明了SIRT7能影响到OSX,那么接下来,作者探究SIRT7是否与OSX有物理上的相互作用(即是否是直接结合)


SFig.3d:作者往MC3T3-E1细胞中,同时转染进了能表达pcDNA3-3×HA-OSX(与OSX结合)和 pcDNA3-FLAG-SIRT7(与SIRT结合)的质粒,然后细胞用 anti-HA 抗体(红色荧光)来标记HA(间接标记OSX),用 anti-FLAG 抗体(绿色荧光)来标记FLAG(间接标记SIRT7)。右下图可以反映OSX和SIRT7是紧密结合的,因此显黄色。


Fig.5c-d:免疫共沉淀也证明了这一点。(c)用SIRT7能把OSX给拉下来,(d)用OSX能把SIRT7给拉下来。

为了确定两者结合的区域,作者用了SIRT7不同的缺失突变体来和OSX一起。


Fig.5e:左上是SIRT7的结构示意图,左下是将SIRT7分割成若干部分,构建成不同的突变体后,各自与OSX混一起,最后发现M2能拉下来的OSX最多,提示:SIRT7与OSX结合的区域在M2图示的区域。


SFig.3c:中间两行示:用NAM(抑制去乙酰化)处理的OSX(乙酰化的多)更容易结合SIRT7,上面一行示:没有NAM处理的293T细胞也出现了条带,可能是因为这是OSX过表达的细胞,所以里面也含有大量的乙酰化的OSX。

综上:SIRT7与OSX能直接结合,并且对乙酰化的OSX亲和力更高,这个结果提示:SIRT7跟OSX可能就是处于一个酶跟催化底物的关系。


SFig.3e:接下来作者用NAM处理了U2OS,MC3T3-E1,C3H/10T1/2这3个成骨相关的细胞系24h,发现乙酰化的OSX的活性是下降的;
Fig.3f:SIRT7 KD 时,OSX的活性也是下降的,过表达SIRT7能逆转这种下降趋势,过表达SIRT7(H188Y)突变体则不能;
提示:SIRT7的这种酶特性是OSX活性所必须的。


有报道OSX会经过磷酸化、乙酰化、泛素化的修饰,这些翻译后修饰会调控它自身的蛋白稳定性或与DNA的结合,但并没有报道过这些修饰还会影响它在成骨细胞中的功能活性。因此作者探究SIRT7使OSX的活性上升,是否是因为改变了它的蛋白稳定性?


Fig5g:在SIRT7 KD时,OSX并没有减少,可见并不是因为SIRT7改变了OSX的稳定性;

5.SIRT7通过使OSX第368位赖氨酸的去乙酰化来促进其转录活性。


Fig6a:同样的方法,这次用OSX不同的部分去拉SIRT7,提示OSX的C末端(含有锌指结构)区域与SIRT7结合得最紧密,而N末端的区域与SIRT7的结合就没那么紧密了。


Fig6b:SIRT7不足,只能影响到完整的OSX的活性,而对于仅含有27-270(不含C末端的锌指结构)的OSX的活性,并不能影响到。

已有报道称:OSX C-末端区域能以一种不明机制来减少N-末端的转录活性。跟作者得出来的结论一致,在仅含有27-270(不含C末端的锌指结构)的OSX的活性明显高于完整的OSX的活性。
综上:作者假设,SIRT7是通过与OSX C-末端的结合,来调控OSX N-末端的活性。

OSX 的C末端区域有10个赖氨酸残基,为了探究是SIRT7的靶点,作者将这10个赖氨酸依次用精氨酸代替,构建10个不同的突变体。

Fig6c:作者发现OSX 第368位赖氨酸残基突变体出现一个明显地OSX活性上升,提示,K368正是这关键的位点。

为了去除蛋白质稳定性对实验的影响,作者用了MG132(蛋白酶抑制剂),消除了蛋白酶对蛋白质的水解作用。


SFig4a:在OSX蛋白量没有显著改变的情况下,K368突变的OSX依旧显著地增高了活性;


Fig6d:SIRT7 KD同样无法对K368R OSX造成影响;

Fig6e:不仅如此,K368R还能逆转SIRT7 KD所带来的成骨细胞矿化不足的影响;


SFig.4b有趣的是,K368在老鼠、人、青蛙、斑马鱼中都是高度保守存在的。

综上,这些发现都支持我们的假设Fig6f:SIRT7通过让OSX C-末端的K368 的去乙酰化来促进OSX N-末端的活性。



6.OSX的赖氨酸可以被SIRT7和SIRT1去丙酰化。
因为SIRT7处理的是去乙酰化,所以作者又想看是否在颅盖骨的成骨细胞和MC3T3-E1细胞中,OSX是否主要处于乙酰化状态,然后SIRT7通过去乙酰化从而改变成骨分化的。


SFig.5a-b:作者先NAM处理组蛋白H3,P300-myc转染OSX(两种方式都是增加H3组蛋白与OSX的乙酰化),来验证用WB检测赖氨酸乙酰化方法没有问题;



这个Wb方法,其实就是相同的蛋白跑了3张膜,然后分别用了 OSX特异性抗体、乙酰化OSX特异性抗体、丙酰化OSX特异性抗体,从而可以得出乙酰化、丙酰化的多少。


Fig.7a:运用这个方法,但是作者发现在主要的成骨细胞中,OSX的乙酰化几乎检测不到,SFig.5c:在过表达OSX的MC3T3-E1细胞中也基本一样(TSA抑制组蛋白去乙酰化)。


因为sirtuins(去乙酰化酶)也可以去掉其他形式的赖氨酸酰化,例如丙酰化,于是用了丙酰化的抗体。与乙酰化不同的是,丙酰化的OSX在成骨细胞和过表达OSX的MC3T3-E1细胞中能够被清楚地探测到
作者下一步评价 OSX的乙酰化/丙酰化是否受SIRT7调节。


Fig.7b-c:Sirt7 KO小鼠分离的成骨细胞(in vitro)和其头盖骨中的成骨细胞(in vivo),OSX的丙酰化都增加,相比较之下,乙酰化并没有明显地改变。SFig.5d:Sirt7 KD的MC3T3-E1细胞中也得到相似的结论。


Fig7d:增加SIRT7可以减少OSX的丙酰化,SIRT7(H188Y)突变体则不能,这些结果表明,SIRT7在成骨细胞中减少的是丙酰化,而不是乙酰化。

为了明确丙酰化的位点,作者用NAM(抑制去乙酰化)和Na-prop(促进丙酰化)处理了OSX过表达的293T细胞,然后打了质谱,明确了 K41,45,358,386这四个位点可以丙酰化。同时,也发现了几个可以乙酰化的赖氨酸位点,尽管之前Wb时其侦测的结果很弱。然而,尽管打了许多遍质谱,之前Wb跑出来的K368赖氨酸乙酰化并没能检测出来。(这个问题作者也搞不明白,把遗憾留到了discussion,还需要后人更加详尽的分析)。


Fig.7e:OSX N末端上三个赖氨酸位点(K41,45,46)突变,会使赖氨酸的丙酰化减少,提示,在这三个位点中,在OSX丙酰化中扮演重要角色。


Fig.7f:最后,我们也发现了OSX K368突变,也会减少OSX的丙酰化,加入SIRT7也不能逆转这种减少趋势。


综上,SIRT7与OSX C-末端结合,使K368去乙酰化;加入SIRT7又能使OSX N-末端去丙酰化;有研究表明,OSX C-末端区域能以一种不明机制来减少N-末端的转录活性。这些结果提示:SIRT7调节 K368的去乙酰化,来促进OSX N-末端的去丙酰化。

来到这里,作者理所当然的得到推测:丙酰化的OSX肯定是抑制其转录活性的。因为之前的细胞实验得出来的结论是:SIRT7使OSX乙酰化,这是OSX的转录活性增高,现在又得出了SIRT7能促进去丙酰化,也就是去丙酰化时活性是增高的,所以反面,丙酰化时活性降低是可预期的。

SFig.5f:果不其然,作者用Na-prop(促进丙酰化)处理MC3T3-E1细胞后,早期成骨细胞分化的相关基因的表达被抑制了;

Fig.7g:Na-prop(促进丙酰化)处理后,OSX的活性也下降了;

为了得到OSX赖氨酸丙酰化减少其活性的更直接的证据

Fig.7h:作者直接将OSX活性的报告载体与 丙酰化和非丙酰化的OSX混一起,得出与预计相同的结果,丙酰化的OSX确实能直接减少了活性。

已有报道:SIRT1也有去丙酰化的作用,而SIRT6并没有这个功能,于是作者再次想探究,SIRT1是否也会引起OSX的去丙酰化,并且这种功能能否被SIRT7所促进。


SFig.7a:SIRT1确实能拉下OSX;
Fig.8b:SIRT1能减少OSX的丙酰化,并且,SIRT1和SIRT7联合使用的话,OSX丙酰化的条带基本看不太清了。


Fig.8c: SIRT1和SIRT7促进了OSX的活性;


Fig.8d:与之前的Fig.6d对比可得出:SIRT1还能对K368突变的OSX起作用,支持SIRT1与SIRT7是一个合作关系,不是作用与同一个位点的。

总结:
综上,SIRT7调节的OSX K368位点的去乙酰化促进OSX N-末端的去丙酰化(该去丙酰化也能被SIRT1激活),以此来增加OSX的转录活性。


参考文献:

1 Fukuda M, Yoshizawa T, Karim MF et al. SIRT7 has a critical role in bone formation by regulating lysine acylation of SP7/Osterix. Nat Commun 2018; 9:2833.

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