过敏洗剂的高效液相色谱指纹图谱研究

　　过敏洗剂的高效液相色谱指纹图谱研究

　　肖淼生1，朱海涛1，张幼林1，尹聪聪2，黄良永1(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000;2.湖北医药学院药学院，湖北十堰442000)

　　[摘要]目的：按照过敏洗浴方的生产工艺制备过敏洗剂，测定过敏洗剂的高效液相色谱( HPLC)指纹图谱，为质量控制提供参考。方法：色谱柱Waters Sunfire C.。(250 mmx4.6 mm，5 l_cm)，乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，流速1.O mL/min.检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10 yL，采用HPLC二元梯度洗脱法绘制过敏洗剂的指纹图谱。结果：11批过敏洗剂标定15个共有峰，指认5个已知峰为绿原酸、升麻苷、木犀草苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷和甘草酸。结论：本研究建立的过敏洗剂HPLC指纹图谱测定方法具有较好的专属性、重复性和实用性，色谱峰信息量大，为全面控制制剂的质量提供了可靠的方法。

　　[关键词]过敏洗剂;高效液相色谱;指纹图谱

　　[中图分类号] R917 [文献标识码]A [文章编号]1672-108X(2018)05-0046-03

　　过敏洗剂是湖北医药学院附属十堰市太和医院皮肤病治疗中心根据传统过敏洗浴方研制的中药复方洗剂，临床应用多年，准备申报新制剂批准文号。处方由防风、金银花、甘草、地肤子、荆芥、薄荷、黄精七味中药组成，具有清热利湿、祛风止痒、解表散风、透疹、疗疮、止痛、止痉之功效，主要用于过敏性皮肤病的各种临床症状的治疗，如皮炎、湿疹、荨麻疹、药疹、接触性皮炎等引起的皮肤发红、发痒、红肿。过敏洗剂可局部搽洗，也可稀释后全身洗浴，疗效好，深受患者欢迎。为了保证制剂质量稳定可控，在制定质量标准的同时，笔者参考有关文献[1]。应用高效液相色谱( HPLC)二元梯度洗脱法，建立了过敏洗剂的HPLC指纹图谱测定条件，绘制11批样品的指纹图谱，获得了以共有色谱峰组成的参照指纹图谱，可用于控制过敏洗剂的质量。

　　1 仪器和试剂

　　美国DIONEX U3000色谱系统(SRD3400在线脱机，HPG3400高压四元梯度泵，WPS3000TSI.自动进样器，TCC3000柱温箱，二极管阵列检测器DAD，Chromeleon色谱工作站);RE-3000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KM-340超声清洗机(大功率250 W，40 kHz，广东科盟电器有限公司);AUW120D电子分析天平(十万分之一，日本岛津公司)。乙腈、甲醇为色谱纯(美国TIDA公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

　　对照品绿原酸( 110753-200413，100%)、升麻苷(111522 -201511，94. 8010)、木犀草苷(111720-200905.96. 5010)、5-0-甲基维斯阿米醇苷(111523-201007，96.5%)、甘草酸铵( 110731-201418 ,93. 1010)均购于中国食品药品检定研究院;过敏洗剂(医院制剂室自制，每瓶250 mL，批号20160226 .201601125 .20160119 .20160107、20151221. 20151213. 20151204、20161126、20161122.20161104 .20161025)。

　　2方法和结果

　　2.1 过敏洗剂的制备

　　处方：防风60 g，金银花60 g，甘草60 g，地肤子60 g，荆芥60 g，薄荷120 g，黄精120 g。按处方称取药材，加水煎煮2次(第一次加水1 000 mL，25 min;第二次加水1 000 mL，20 min)，滤过，合并滤液，浓缩至1000 mL，每瓶装250 mL，即得。

　　2.2 HPLC色谱图的测定

　　2.2.1 色谱条件色谱柱为Waters Sunfire C18(250 mmX4.6 mm，5斗m);流动相A为乙腈，流动相B为0.1010磷酸溶液，按表1进行梯度洗脱;检测波长254 nm;柱温30 cC;流速1.0 mU min;进样量10卜LL。理论板数以升麻苷峰计应不低于10 000。

　　表1 梯度洗脱程序 %

　　2.2.2样品溶液的制备

　　2.2.2.1 混合对照品溶液精密称取绿原酸16.0 mg、升麻苷12.0 mg、木犀草苷8.0 mg、5-0-甲基维斯阿米醇苷12.0 mg、甘草酸铵10.2 mg(相当于甘草酸10.0 mg)，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得5种对照品储备液;再分别精密量取0. 50、0.25、0.10、0.10、0. 50 mL，置于10 mL容量瓶中混合后用甲醇定容，即得每毫升含绿原酸80.0vg、升麻苷30.0V-g、木犀草苷8.0lc9、5-0-甲基维斯阿米醇苷12.0 pdg、甘草酸50.0 V-g的混合对照品溶液。

　　2.2.2.2供试品溶液取某批号过敏洗剂1瓶，摇匀，精密量取10 mL，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用甲醇转移至25 mL容量瓶中并定容，超声10 min( 240 W，40 kH)，放置至室温后，用甲醇补充至刻度，过滤，即得供试品溶液。

　　2.2.2.3 阴性对照品溶液 同时去掉过敏洗剂处方中的金银花、防风和甘草三种药材，按原工艺制备过敏洗剂的阴性样品，并依照供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

　　2.2.3专属性实验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 yL，分别注入HPLC色谱仪。结果显示，在本实验色谱条件下，供试品溶液和混合对照品溶液在相同位置有绿原酸(1)、升麻苷(2)、木犀草苷(3)、5-0-甲基维斯阿米醇苷(4)和甘草酸(5)的峰，各成分峰与其相邻峰完全分离，理论板数(以升麻苷峰计)>10 000;而阴性对照品溶液未见这5个成分峰。见图1。

　　2.3 指纹图谱方法学考察

　　2.3.1 精密度实验 取同一批号( 20160226)的供试品溶液，按本实验色谱条件连续进样6次，记录色谱图，测定15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，15个共有峰相对保留时间的RSD均<0.08%，相对峰面积的RSD均<1.3%，表明本实验方法的精密度良好。

　　2.3.2重复性实验取同一批号(20160226)的样品，重复制备供试品溶液6份，按本实验色谱条件分别测定其色谱图。结果显示相对保留时间稳定，15个共有峰相对保留时间RSD均<0. 15 010，相对峰面积RSD均<2.0010，符合指纹图谱要求，表明本实验方法重复性较好。

　　2.3.3稳定性实验取同一批号( 20160226)的供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、12 h后，分别按本实验色谱条件测定并记录色谱图。结果显示15个共有峰相对保留时间的RSD均<0.16%，相对峰面积的RSD均<1. 7%，表明供试品溶液在常温下12 h内性质稳定。

　　2.4指纹图谱的相似性评价

　　2.4.1 共有指纹峰的标定取我院2015 -2016年生产的11批过敏洗剂，制备供试品溶液，分别在本实验色谱条件下测定色谱图。使用中国食品药品检验鉴定研究院发布的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”软件，在裁剪5 min之前的溶剂和杂质峰后，采用自动匹配法生成共有特征图谱R(图2)。结果显示，11批供试品共标定15个共有峰，其中5个已知峰为绿原酸(4)、升麻苷(7)、木犀草苷(8)、5-0-甲基维斯阿米醇苷(9)和甘草酸(15);11批样品特征图谱与共有特征图谱R的相似度在0. 964~0.994，提示图谱R具有较好的实用性。

　　A.混合对照品溶液;B.供试品溶液;C.阴性对照溶液

　　图1HPLC色谱图

　　2.4.2 已知成分的确认 图谱R中4号、7号、8号、9号、15号峰保留时间分别与绿原酸、升麻苷、木犀草苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷和甘草酸对照品峰一致，再通过DAD检测器检测，在5个已知峰的保留时间处，在200~ 400 nm波长范围内，间隔0.5 nm扫描，得到的扫描图和对照品扫描图完全吻合，且无杂质干扰，由此可确认过敏洗剂中含有绿原酸、升麻苷、木犀草苷、5 -0-甲基维斯阿米醇苷和甘草酸5种已知成分。

　　2.4.3参照峰的确定7号峰为升麻苷峰，保留时间约为27.2 min，在色谱图的中间位置，峰形对称性好，峰面积值稳定，故选择升麻苷峰为作为参照峰(S)。设定参照峰的保留时间和峰面积为1，计算1~ 15号峰相对参照峰的保留时间和峰面积，结果显示11批样品1~15号峰相对保留时间的RSD均<0.5010，相对峰面积的RSD均>5 010(7号峰除外，9号峰高达46.8 010)。

　　3讨论

　　在色谱条件的筛选中，流动相使用乙腈和0. 10_10磷酸等度洗脱，色谱峰分布不均，峰形不对称;选用梯度洗脱，基线平稳，色谱峰分布均匀，各成分峰与相邻色谱峰分离完全，可达到测定要求。5种已知成分的大吸收波长分别为252 nm、254 nm、327 nm、330 nm、350 nm，经过检测波的筛选实验，结果显示254 nm波长处测得的色谱图中已知成分的峰面积大且信息量多，故采用254 nm作为检测波长。结果表明本实验建立的色谱条件专属性好。

　　过敏洗剂的生产工艺采用传统的水煎煮法提取。在供试品制备时，为了除去样品中的大量鞣质和植物蛋白，采用先将样品浓缩近干，再用甲醇直接提取(甲醇浓度在90%以上)，不仅能提高目标成分的提取率，还能保证流动相中不会有沉淀析出，方法简便，复性好，能满足测定需要。

　　本实验结果显示，11批样品特征图谱与共有特征图谱R的相似度均>0. 95，说明本实验方法测定过敏洗剂的HPLC指纹图谱稳定可靠;11批样品指纹峰的相对保留时间基本一致，但相对峰面积波动较大，说明不同生产批次的过敏洗剂成分含量差异较大，可能与中药材的来源、质量等因素有关。为了保证过敏洗剂的质量稳定，应先保证原料药材的质量稳定。总之，利用HPLC指纹图谱来控制过敏洗剂的质量是可行的，本实验提供了可靠的方法。

　　参考文献

　　[1]国家药典委员会，中华人民共和国药典(一部)[M].2015版，北京：化学工业出版社，2015：86-377.

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