早期母婴分离对大鼠海马GFAP表达的影响

　　早期母婴分离对大鼠海马GFAP表达的影响

　　何静 王高华 王慧玲 肖 玲

　　【摘要】目的 比较早年母婴分离对大鼠海马GFAP(CJlial fibrillary acidic protein，胶质细胞原纤维酸性蛋白)表达的影响及成年后行为学的改变，探讨与抑郁相关的可能机制。方法 出生后3天( PND3)的新生雄性鼠从第4天开始和母鼠分开，分为应激敏感组(每天分离时间3h)、应激抵抗组(每天分离时间15min)、正常对照组，每组各20只，持续一周。PND12开始处死一半的取大鼠海马，分别进行蛋白免疫印迹和免疫组化实验检测GFAP，比较不同组GFAP的表达量。PND56开始对剩下的大鼠进行旷场实验和强迫游泳，评价行为学差异。结果母婴分离时间长的大鼠(应激敏感组)与正常组大鼠相比，蛋白免疫印迹和免疫组化结果一致，海马GFAP表达量减少，差异有统计学意义(P<0.05)。母婴分离时间短的大鼠(应激抵抗组)和正常组大鼠相比，海马CFAP表达量差异无统计学意义(P>0.05)。母婴分离时间长的大鼠，成年后表现出旷场总移动距离减少，中心移动距离减少，强迫游泳中不动时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。结论长时间母婴分离使幼年大鼠海马CJFAP表达减少，成年后出现抑郁样行为，可能和星形胶质细胞重吸收谷氨酸减少影响突触可塑性有关。

　　【关键词】母婴分离;GFAP;星形胶质细胞;谷氨酸;突触可塑性

　　【中图分类号】R749.059 【文献标识码】A 【文章编号】1673-2952( 2018) 05-0827-04

　　The effect of early maternal deprivation on the GFAP expression of rats in hippocampus

　　对大鼠而言，PND4-PND14是大脑发育的关键时期，基础的ACTH和肾上腺皮质酮处于低水平，对压力的反应也是受抑制的，保护大脑发育免受环境影响。15min母爱剥夺会导致血浆CORT升高，3h母爱剥夺会导致苔藓纤维减少。长时间母婴分离可能导致成年后抑郁样行为，引起海马神经再生减少，突触可塑性相关蛋白表达减少。由于海马齿状回很大程度上是后天形成，早期压力对海马神经再生和结构可塑性的影响更为深远。尽管许多研究早年应激改变神经可塑性，但是具体的细胞和分子机制未知，尤其是神经胶质细胞。有证据表明，抑郁患者和双相情感障碍患者，星形胶质细胞数量和密度在前额叶和扣带回减少。抑郁和焦虑的神经发生机制与兴奋性神经递质谷氨酸增加，抑制性神经递质GABA减少有关。神经胶质细胞，尤其是星形胶质细胞，维持谷氨酸/GABA平衡有重要作用。

　　CJFAP作为星形胶质细胞的标志，是一种中间丝蛋白，主要在星形胶质细胞中表达，发现抑郁患者前额叶CJFAP阳性细胞减少。临床研究发现抑郁患者海马CAl, CA2的GFAP表达量减少。星形胶质细胞在维持神经可塑性有重要作用，主要通过多种机制包括突触再生的支持，突触维持和神经营养因子的分泌。因此本研究主要研究早年母婴分离对大鼠成年后行为学的改变，对海马星形胶质细胞GFAP表达的影响，探讨抑郁发生机制的可能联系。

　　1材料与方法

　　1.1 实验动物

　　清洁级健康SD孕鼠26只，购自同济医学院实验动物中心。实验期间，室温22℃—25 cC，每日光照12 h，实验期间，大鼠自由摄食摄水。实验过程得到武汉大学实验动物伦理委员会批准。

　　1.2主要试剂与材料

　　兔GFAP -抗购白Abcam(批号ab68428);CAPDH(批号2118s)一抗购自cellsignal; HRP标记羊抗兔二抗( BL003A)购自Biosharp; ECL发光试剂盒购自碧云天;免疫组化试剂盒购自迈新技术公司(批号1705179921);4，6-二脒基一2一苯基吲哚( DAPI)购自碧云天生物技术研究所;DAB购自碧云天生物技术研究所

　　1.3 实验动物分组与模型制作

　　新生SD雄性大鼠，适应性喂养至出生后第三天PND3，出生后第四天开始，每日上午(9：00—12:00)开始接受母婴分离，利用无色透明聚乙烯隔板将幼鼠和母鼠分开。应激敏感组母婴分离3小时/次，应激抵抗组母婴分离15分钟/次，每日1次，持续一周。按母婴分离时间长短，不同窝老鼠按照随机数字表法分为三组，分别为应激敏感组(每日分离时间3小时)，应激抵抗组(每日分离时间为15min)，正常对照组，每组20只。

　　1.4蛋白免疫印迹PND12

　　处死大鼠，取出大鼠海马，加裂解液，Cocktail蛋白酶抑制剂匀浆后，12000rpm离心15min，取上清。用BCA法测定蛋白浓度。经过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时后，TBST Sminx3次，加入一抗兔CJFAP(1：5000)4℃过夜，TBST 10minx3次，加入HRP羊抗兔(1：100)二抗，ECL化学发光法显影。GAPDH(1：1000)作为内参参照。计算各条带密度相对值。Image-Lab软件分析并计算条带密度相对值。

　　1.5标本采集与免疫组化

　　大鼠经1 010戊巴比妥(40mg/kg)麻醉后，开胸并暴露出心脏，心脏收缩时从左心室插入灌流针至主动脉固定。先灌注生理盐水100ml-200ml( 4。C)，直至流出的液体清亮，再用4 010多聚甲醛灌注，先快后慢，直至四肢僵硬。将大鼠断头，取出脑组织，放在4%甲醛溶液中过夜，经过酒精脱水及二甲苯透明后，石蜡包埋。取大鼠海马做连续切片。经过烤片，二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水等，微波抗原修复，3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶，免疫组化放大试剂，一抗兔GFAP(1：100)4℃过夜，PBS代替一抗作为阴性对照，DAB(1：150)显色，苏木精复染，中性树胶封片。在Olympus正置显微镜下拍照，曝光时间，光强等条件相同。图片用Image-Pro Plus处理。

　　1.6动物行为评定

　　在CUMS前即出生后第56天(PND56)进行糖水偏好及旷场实验。旷场实验：旷场大小为100 cm×100 cm×30cm，将大鼠置于旷场中心内，使用动物行为自动跟踪系统(Ethovision3.0，荷兰)记录并分析大鼠在旷场内5 min的行为，主要观测指标为总行程，平均运动速度，中心移动距离。

　　强迫游泳：大鼠放在透明圆柱形的水缸中(直径30cm，高Im)，水深30cm，大鼠放在水缸中适应性游泳2分钟后开始记录5分钟内大鼠不动时间。不动时间的判断是大鼠漂浮在水面上或者仅为了保持头部留在水面的小范围滑动。

　　1.7统计学处理

　　用SPSS19.0进行统计分析。用单因素方差分析，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者首先进行对数转换或者平方根转换，若方差仍不齐，进行Games-Howell检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 蛋白免疫印迹

　　应激敏感组，应激抵抗组，正常对照组三组之间海马GFAP表达量有差异(F=4.30，P=0.03，检验水准P< 0.05)。Games-Howell两两比较发现，应激敏感组与正常对照组相比，GFAP相对表达量减少，差异有统计学意义(P=0.01)，应激抵抗组和正常对照组相比，GFAP相对表达量可能有下降的趋势，差异没有统计学意义(P=0.60)。长时间(超过3小时)母婴分离明显使GFAP表达量下降。

　　2.2免疫组化

　　应激敏感组，应激抵抗组，正常对照组三组之间海马GFAP平均密度有差异(F=3.67，P=0.049，检验水准P<0.05)。LSD两两比较发现，应激敏感组和正常对照组相比，GFAP平均密度明显降低，差异有统计学意义(P=0.02)。应激抵抗组和正常对照组相比，GFAP平均密度有下降的趋势，两者差异没有统计学意义(P=0.42)。长时间母婴分离使海马GFAP平均密度降低。

　　2.3动物行为学评价

　　早年母婴分离后，成年后的大鼠PND56，与正常对照组相比，母婴分离组旷场总移动距离有差异，差异有统计学学意义( F=8.47，P=O.OOl)，应激敏感组低于正常对照组，差异有统计学意义( P=O.OOl)，应激抵抗组和正常对照组相比，差异没有统计学意义(P=0.57)。在中心移动距离中，i组之间差异有统计学意义( F=4.63，P=0.02).应激敏感组低于正常对照组，差异有统计学意义( P=0.005)，应激抵抗组和正常对照组相比，差异没有统计学意义(P=0.26)。强迫游泳中，不动时间存在差异，差异有统计学意义( F=5.20，P=O.Ol)，应激敏感组不动时间长于正常组和应激抵抗组，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3讨论

　　本小组既往研究发现，母婴分离后的大鼠成年后出现抑郁样行为，神经可塑性相关蛋白如BNDF，CREB，表达量减少。早年应激改变成年大鼠海马齿状回神经再生以及海马神经营养因子水平，可能增加抑郁易感。本研究中，长时间母婴分离的大鼠，成年后表现出活动量减少，探索减少，强迫游泳中不动时间延长，无助感增加。

　　母婴分离使相关脑区GFAP阳性星形胶质细胞减少，比如前额叶、海马，通过影像学 3和死后尸检研究哺]，同样在应激相关行为和抑郁中得到了类似的结论。GFAP表达和星形胶质细胞反应活性密切相关，GFAP在保持星形胶质细胞形态学有重要作用。压力诱导GFAP减少，可能和纤维性星形胶质细胞重排列有关，被称为神经胶质细胞的回缩。在成年动物下丘脑神经生理学中得到了证实，与神经元受到不同的刺激激活有关，包括缺水、母亲行为诱导、限制压力等。

　　许多研究表明HPA轴的改变导致压力相关障碍比如抑郁易感性。海马是大脑对压力和压力相关激素敏感的区域之一，与学习、记忆、行为学适应有关。海马对HPA轴有负反馈调节作用，并含有丰富的糖皮质激素和盐皮质激素受体。早期压力暴露可以影响海马的结构和功能。抑郁患者中海马体积一致减少，尽管海马体积减少的功能和结构基础尚且未知，动物研究表明慢性压力可以引起细胞和树突的萎缩，改变神经胶质细胞的数目，减少成年大鼠神经再生。成年海马神经再生是结构可塑性的标志，在海马功能研究和抗抑郁药物研究中也有发现。压力和糖皮质激素潜在影响神经再生。

　　母婴分离引起大脑神经可塑性的改变，包括突触可塑性的改变。神经胶质细胞与突触可塑性的关系，尤其是星形胶质细胞病理学改变如何影响突触塑性，进而影响海马神经再生，目前存在多种假设。其中，“三重突触”的概念被提出，认为星形胶质细胞是突触的第三种成分。星形胶质细胞是构成三重突触整体必须的部分，调节神经元的兴奋。许多研究揭示了神经元和星形胶质细胞之间双向信息传递。CNS丰富的突触类型一谷氨酸突触，星形胶质细胞控制着细胞外谷氨酸的水平(哺乳动物大脑的主要兴奋性神经递质)，从而维持兴奋性神经递质(谷氨酸)和抑制性神经递质(GABA，v一氨基丁酸)平衡。吸收释放的谷氨酸是星形胶质细胞在三重突触中的重要作用。星形胶质细胞与超过90%谷氨酸重吸收和代谢有关。因此，星形胶质细胞的减少基本的后果是谷氨酸重吸收减少，导致突触间隙谷氨酸过度累积。谷氨酸能神经系统在兴奋一抑制平衡中占主导是抑郁的病理发生机制之一。在抑郁患者大脑和脑脊液中发现谷氨酸增加，抑制谷氨酸具有抗抑郁的作用。星形胶质细胞可能受神经递质的调节。单胺类神经递质可能对星形胶质细胞有作用，口肾上腺素能受体激活增加CJFAP免疫活性，使五羟色胺减少。长期压力和慢性肾上腺皮质酮治疗减少脑皮质和海马CJFAPmRNA[12]。

　　本研究不足之处在于缺乏对谷氨酸和GABA神经递质水平的检测，谷氨酸和CJABA表达水平可以更好的论证星形胶质细胞在早年应激引起的抑郁中的作用机制。

　　综上所述，早年长期母婴分离使GFAP表达减少，出现抑郁样行为，突触可塑性降低，可能和谷氨酸重吸收减少有关。

　　参考文献

　　1.舒畅。早年母爱剥夺对成年大鼠海马神经再生，BDNF和CREB表达的影响[Z]。武汉大学，2013.

　　2. Altman J,Bayer SA. Mosaic organization of the hippocampal neu- roepithelium and the multiple germinal sources of dentate granule cells.Journalofcomparative neurology, 1990; 301 (3): 325-342

　　3. Cotter DR, Pariante CIVL, Everall IP. Glial cell abnormalitiesin major psychiatric disorders: the evidenc.e anrl implications. Brain research hulletin, 2001; 55 ( 5 ): 585-595

　　4. Owska MS, Szewczyk B, Niak MW, Pt al. Clial degeneration as a model of depression.2013.

　　5. Vythilingam M, Heim C, NewpOrlj, et al. Childhoorltrauma asso- ciated with smaller hippocampal volume in women with major deprP,ssion. American JoumalofPsychiatry, 2002; 159 ( 12): 2072-2080

　　6. Harrison PJ. The neuropathology of primary mood disorder.Brain, 2002; 125 (7): 1428-1449

　　7. Salm AK. Mechanisms of glial retraction in the hypothalarrm neurohy- pophysial system of the rat. Experimental physiology, 2000; 85 ( sl )

　　8.Oomen C.A, Cirardi C, Cahyadi R, et al. Opposite Fffects of Early Maternal Deprivation on Neurogenesis in Male versus Female Rats.2008.

　　9. Araque A, Parpura V, Sanzgiri RP, et al. rrripartite synapses: glia, the unacknowledged partner [J] . Trends in neurosci- ences, 1999; 22 (5): 208-215

　　10. John C.S, Smith KL, Veer AV, et al. Blockade of astrocytic glutamate uptake in the prefrontal cortex induces anhedonia. Neuropsychopharmacology, 2012; 37 ( 11 ): 2467