miR-335调控ROCK1对宫颈癌细胞作用的研究

　　miR-335调控ROCK1对宫颈癌细胞作用的研究

　　秦海霞 李少平 朱利红 张全华 王世进 高丽云

　　【摘要】目的探讨miR-335调控Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCKl)对宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响。方法选取人正常官颈细胞系Ectl/E6E7、宫颈癌细胞系SiHa，分别转染miR-335 mimic、miR-335inhibitor、control mimic及control inhibitor，采用RT-PCR检测miR-335表达，Western blot检测ROCK1蛋白表达，Transwell小室实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。结果与Ectl/E6E7细胞相比较，在SiHa中miR-335表达显著降低，ROCK1蛋白表达显著增高(P<0.05)。

　　转染miR-335mimic后SiHa细胞中miR-335表达显著增高，ROCK1蛋白表达显著降低(P<0.05);转染miR-335 inhibitor后SiHa细胞中miR-335表达显著降低，ROCK1蛋白表达显著增高(P<0.05)。转染miR-335mimic后SiHa细胞侵袭、迁移能力显著降低，而转染miR-335 inhibitor后则显著增高(P<0.05)。与转染controlmumc相比，共转染miR-335 mimic与野生型ROCKl-WT可使SiHa荧光素酶活性及ROCKl mRNA明显降低(P<0.05)。结论miR-335可抑制官颈癌细胞侵袭及迁移，可能通过调控ROCK1发挥作用。

　　【关键词】miR-335; ROCK1,宫颈癌,侵袭,迁移

　　doi:10 .13390/j .issn.1672-1861.2018.05 .008

　　基金项目：河南省医学科技攻关计划项目( 201602157)

　　官颈癌是临床常见女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌。微小RNA( miRNA)属于内源性非编码小分子RNA，其可从基因转录水平实现对靶基因的调控‘捌。研究发现，miR-335可能在官颈癌发病中发挥类似抑癌基因的作用，但其对下游靶基因的调控机制尚未明确口1。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1( ROCKl)属于Rho家族成员，其表达与官颈癌细胞侵袭和迁移的相关性已被证实，调控ROCK1表达可能成为宫颈癌靶向治疗的新思路。研究证实，iR-335可通过调控ROCK1抑制卵巢癌、膀胱癌和骨肉瘤等多种恶性肿瘤侵袭及转移。但是否可通过调控ROCK1抑制官颈癌细胞侵袭及迁移尚未可知。本研究旨在探讨miR-335调控ROCK1对宫颈癌细胞侵袭及迁移的影响，以期为官颈癌的分子靶向治疗提供依据。

　　资料与方法

　　一、实验材料

　　人正常官颈细胞系Ectlf E6E7、官颈癌细胞系SiHa购于美国ATCC;DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶、胎牛血清购于Hyclone公司;RT-PCR试剂、ROCK1单克隆抗体购于大连Takara公司：western blot试剂盒购于南京建成生物有限公司;LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂购于Invitrogen公司;miR-335 mimic、miR-335inhibitor购于Ambion公司;双荧光素酶检测试剂盒购于美国Promega公司。

　　二、实验方法

　　1.细胞培养：常规复苏SiHa、Ectl/E6E7细胞，用DMEM培养液(含100/0胎牛血清、10r/0双抗)重悬浮细胞，37℃、5% C02恒温培养，换液1次/天，收集对数生长期细胞。

　　2.细胞转染：收集对数生长期的SiHa细胞，接种于细胞培养板中，2×l05 cells/well，分4组，每组3孔，各组分别转染miR-335mimic、miR-335inhibitor、control mimic、control inhibitor，置于：37℃、50/0 C02培养箱中培养24 h。

　　3.RT-PCR法检测miR-335表达：收集转染后各组细胞，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，后逆转录总RNA至cDNA，取逆转录产物行RT-PCR(SYBR Green法)，U6为内参。miR-335逆转录引物序列：上游5’一AGGTATTCGCACTGGATACGACA-3’，下游5’一GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG-3’;miR- 335扩增引物序列：上游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游5’-AGCCGTCAAGAGCAATAACGAA一3’。U6扩增引物序列：上游5’.CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’一AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

　　4.Western blot法检测ROCK1蛋白表达：收集转染后各组细胞，蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取200 vl样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，4℃封闭4h，后依次加入1：2 000浓度I抗(兔抗人ROCK1和兔抗人B-actin)、1：500浓度HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。

　　5.划痕实验检测细胞迁移能力：收集转染后各组细胞，置于恒温培养箱继续培养，待细胞融合率达90010左右时，用200 yl枪头垂直于6孔L板底部做横线划痕，之后细胞继续置于恒温培养箱培养24 h后，于倒置光镜下拍照(×100)观察，利用Image J软件测量划痕区域宽度，并计算细胞划痕愈合率。

　　6.Transwell小室法检测细胞侵袭能力：收集转染后各组细胞，调整细胞浓度至2×l05个/ml，分别取200 pL1细胞液加入预铺设稀释Matrigel胶的上室，用DMEM培养液补至1 ml，下室加入600 pul DMEM培养基。置于恒温培养箱培养24 h，取出小室，擦拭Matrigel胶及胶上细胞，将小室置于40/0多聚甲醛中固定20 min，室温下风干，用Gimesa染液浸染20 min，取出PC膜放置于载玻片上，以树胶封片，光镜下观察小室细胞侵袭情况。随机取6个视野，计算穿过Matrigel基质的平均细胞数。

　　7.双荧光素酶报告基因实验：运用生物学信息软件预测miR335的靶基因为ROCKl(http:

　　//www. targetscan.org/)。以人官颈癌细胞基因组DNA为模板，构建野生型ROCK1 3’-UTR

　　(ROCKl-wt)质粒、突变型ROCK1 3’-UTR( ROCKl-Mut)。收集对数生长期SiHa细胞，用

　　DMEM培养液(10%胎牛血清+1%双抗)调节细胞密度至2×l05 cells/well，将ROCKl-wt、

　　ROCKl-Mut与miR-335mimic或control mimic共转染至SiHa细胞，37℃、50/0 C02恒温培养48 h;测定细胞荧光素酶活性，海肾质粒荧光值 (P<0.05)。

　　三、统计学方法

　　采用SPSS 20.0进行数据分析，计量资料用Mean±SD表示，多组间比较用单因素方差检验， 两两比较用f检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

　　结 果

　　一、SiHa细胞和Ectl/E6E7中miR-335和ROCK1的表达

　　RT-PCR结果显示，官颈癌细胞系SiHa和正常宫颈细胞系Ectl/E6E7中miR-335表

　　达量分别为( 1.03±0.35)和(3.97±1.21)，SiHa中miR-335相对表达量显著低于Ectl/E6E7( P< 0.05);Western blot结果显示，官颈癌细胞系SiHa和正常宫颈细胞系Ectl/E6E7中ROCK1表达量分别为( 104.32±10.43)和(399.86±15.72).SiHa中ROCK1蛋白表达量显著高于Ectl/E6E7( P< 0.05)。

　　转染miR-335 mimic/inhibitor对SiHa中miR-335及ROCK1表达的影响

　　PCR结果显示，转染miR-3 35mimic和control mimic后SiHa细胞miR-335表达量分别为( 5.09 +0.56)和(0.97 +0.33)，转染miR-335inhibitor和control inhibitor后SiHa细胞miR-335表达量分别为( 0.35 +0.07)和(1.01+ 0.35)，转染miR-335mimic后SiHa细胞miR-335表达显著增加，而转染miR-335 inhibitor后SiHa细胞miR-335表达显著降低(P<0.05)。Western blot结果显示，转染miR-335mimic和control mimic后SiHa细胞中ROCK1表达量分别为(108.34±30.23)和( 360.31±105.25)，转染miR-335 inhibitor和control inhibitor后SiHa细胞ROCK1表达量分别为( 720.35±150.97)和(352.68±97.93)，转染miR-335 mimic后ROCK1蛋白表达显著降低，而转染miR-335 inhibitor后ROCK1蛋白表达则显著增高(P<0.05)。

　　转染miR-335 mimic/inhibitor对SiHa侵袭能力的影响

　　Transwell小室实验结果显示，转染miR-335 mimic后SiHa细胞侵袭能力显著降低，转染miR-335 inhibitor后SiHa侵袭能力显著增高注：①P< 0.05，与control mimic组比较;②P<0.05， 与control inhibitor组比较

　　四、转染miR-335 mimic/inhibitor对SiHa迁移能力的影响

　　划痕实验结果显示，转染miR-335 mimic后SiHa细胞迁移能力显著降低，转染miR-335

　　inhibitor后SiHa迁移能力显著增高(P<0.05)，见图2。

　　注：①JP< 0.05，与control mimic组比较;②P< 0.05，

　　与control inhibitor组比较

　　五、验证miR-335对ROCK1的调控作用

　　Target Scan软件分析结果显示，miR-335与ROCK1 3-UTR之间存在7个碱基互补区。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-335 mimic与野生型ROCKl-WT共转染后SiHa细胞荧光活性显著低于control mimic组(P<0.05)。同时采用Western blot检测miR-335 mimic和control mimic与ROCKl-WT共转染后的ROCKl mRNA的相对表达量，发现miR-335 mimic与ROCKl-WT共转染后ROCKl mRNA明显低于control mimic组(P<0.05)。以上数据说明miR-335与ROCK1之间存在负向调控作用。

　　讨 论

　　一、miR-335对官颈癌细胞侵袭及迁移的影响

　　二、 miR-335是近年来新发现的miRNA，其参与恶性肿瘤侵袭与转移的观点已得到普遍认同。Gao等研究显示，miR-335在乳腺癌细胞系中呈现低表达，过表达miR-335可通过抑制原癌基因c-Met表达，实现对乳腺癌细胞迁移的抑制。Gong等吲选取小细胞肺癌细胞系SBC-5为研究对象，并利用慢病毒转染技术调控细胞miR-335表达，结果显示过表达miR-335可显著抑制SBC-5细胞侵袭及迁移能力，而低表达miR-335结果则相反。Chen等研究发现miR-335具有抑制官颈癌HeLa细胞、侵袭及转移的作用。Hela属腺癌细胞，临床上多见的官颈癌类型为鳞癌，为使研究结果显得更有意义，本研究设计采用了SiHa细胞。

　　结果显示，转染miR-335 mimic可明显上调SiHa细胞中miR-335表达，同时使细胞侵袭及迁移能力明显降低;转染miR-335 inhibitor后得出的结果则完全相反，提示miR-335具有调控宫颈癌细胞侵袭及迁移的作用。

　　二、miR-335对宫颈癌细胞侵袭及迁移的作用机制

　　研究证实，miR-335可能在宫颈癌发病中发挥类似抑癌基因的作用，但其对下游靶基因的调控机制尚未明确[3-4]。ROCK1属于Rho效应分子，可通过Rho/ROCK通路激活下游信号分子，进而参与恶性肿瘤侵袭及转移过程。肿瘤环境下，ROCK1可通过与活化的Rho蛋白相结合，暴露ROCK1催化活性中心并使ROCK1得到激活，促使恶性肿瘤细胞肌动蛋白骨架重组，进而提高恶性肿瘤细胞运动能力。研究证实，宫颈癌组织ROCK1表达显著高于正常官颈组织;而过表达ROCK1可激活Rho/ROCK通路，并可在体外显著提高官颈癌细胞Hela侵袭及迁移能力。上述研究提示ROCK1过表达是介导官颈癌侵袭和转移的关键环节。而调控ROCK1表达可能是抑制官颈癌细胞侵袭和转移的有效方法。本研究显示，转染miR-335 mimic可显著降低SiHa细胞中ROCK1表达，而转染miR-335 inhibitor则可提高SiHa细胞中ROCK1表达。故推测，在官颈癌中miR-335与ROCKI之间存在某种负向调控机制。进一步利用基因软件预测、双荧光素酶报告基因实验及Western blot检测证实，miR-335可通过作用于ROCK1 3'UTR发挥抑癌作用，从而印证miR-335与ROCK1之间的调控关系。此外，本研究还观察到，转染miR-335mimic可抑制ROCK1表达，同时降低SiHa细胞侵袭及迁移能力;相反，转染miR-335 inhibitor可促进ROCK1表达，同时提高SiHa细胞侵袭及迁移能力。提示miR-335可通过调控ROCK1抑制宫颈癌细胞侵袭及迁移。

　　综上所述，miR-335可抑制官颈癌细胞侵袭及迁移，其机制可能与调控ROCK1有关，是否存在靶向调控，需要进一步深入研究。

　　参考文献

　　[1]Lapresa M, Parma G, Portuesi R, et al. Neoadjuvant chemotherapy in cervical cancer: an update[Jl. Expert Review of Anticancer Therapy, 2015, 15:1171-1181.

　　[2] Lin S, Gregory RI. Micro RNA biogenesis pathways in cancer.[J]. Nature Reviews Cancer, 2015, 15:321-333.

　　[3] Chen LN, Song YB, Lu YF, et al.miR-335 inhibits cell proliferation, migration and invasion in HeLa cervical cancer cells[Jl. IntJ Clin Exp Pathol, 2016, 9:10351-10362.

　　[4] Pinner S, Sahai E. PDKl regulates cancer cell motility by antagonising inhibition of ROCKl by RhoE.[J]. Nature Cell Biology,2008,10:127-137.

　　[5] 秦海霞，崔红凯，潘莹，等.m1R-335靶向Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶l对卵巢癌细胞增殖的影响[J]中国生物工程杂志，2016, 36:24-31.

　　[6]Wu DY, Niu XB, Pan HX, et al. MicroRNA-335 is downregu- lated in bladder cancer and inhibits cell growth, migration and invasion via targeting ROCKl[Jl. Molecular Medicine Reports,2016, 13:4379-4385.

　　[7] Wang Y, Wang NN, Zeng XD, et al. MicroRNA-335 and its target Rockl synergistically inflencetumor progression and prognosis in osteosarcoma[刀.OncologyLetters, 2017,13:3057-3065.

　　[8] Gao Y,Zeng F,Wu J Y,et al. MiR-335 inhibits migration ofbreast cancer cells through targeting oncoprotein c-Met[Jl. Tu-mor Biology, 2015, 36:2875-2883.

　　[9] Gong M, Ma J, Guillemette R,et al. miR-335 inhibits small cell lung cancer bone metastases via IGF-IR and RANKL pathways[J]. Molecular Cancer Research Mcr, 2014, 12:101-110.

　　[10] Shin JY, Kim YI, Cho SJ, et al. MicroRNA 135a suppresseslymph node metastasis through down-regulation of ROCKl in early gastric cancer[J]. Plos One, 2014, 9:e85205.

　　[11] Hu CB, Li QL, Hu JF, et al. miR-124 Inhibits Growth and Inva- sion of Gastric Cancer by Targeting ROCKl[Jl. Asian Pacific　Journal of Cancer Prevention Apjcp, 2014, 15:6543-6546.

　　[12] Liu X, Chen D, Liu G. Overexpression of RhoA promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells[J]. Biosci-ence, Biotechnology, and Biochemistry, 2014, 78:1-7.