人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA与Ll蛋白联合检测在宫颈癌前病变诊断中的临床价值

　　人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA与Ll蛋白联合检测在宫颈癌前病变诊断中的临床价值

　　王富伟 魏爱婷 邱翠

　　【摘要】 目的探讨人乳头瘤病毒( human papillomavirus, HPV) E6/E7 mRNA和Ll蛋白的联合检测在官颈癌前病变诊断中的临床价值。方法选择353例HPV感染患者为研究对象，分别采用b-DNA技术检测患者TCT标本中E6/E7 mRNA的阳性表达率，免疫组织化学法检测患者宫颈石蜡包埋组织标本中L1蛋白阳性表达率。结果E6/E7 mRNA阳性表达率与宫颈病变严重程度呈正相关(r=0.485，P <0.05)

　　【关键词】宫颈病变;人乳头瘤病毒;E6/E7 mRNA; Ll蛋白

　　官颈癌的发生与HPV的感染有着密切的关系。美国新的宫颈癌筛查指南推荐在30岁及以上女性中以HPV DNA作为首要辅助筛查项目。但其诊断官颈癌前病变时的特异性和阳性预测值相对较低，并且不能区分短暂和持续的感染。本研究分别采用b-DNA技术检测TCT标本中E6/E7mRNA的表达情况，免疫组织化学法检测宫颈石蜡包埋组织标本中HPV Ll蛋白表达情况，评估这两种方法在官颈癌前病变诊断中的临床价值。

　　资料与方法

　　一、研究对象

　　选取2015年1月至2017年4月在河南省漯河医学高等专科学校第三附属医院行官颈液基薄层细胞学检查( TCT)，且通过第二代杂交捕获(hybrid captureⅡ，HC2)法检测HPV阳性的患者353例，随访其组织病理学结果，组织学诊断依据WHO分类标准进行判读。患者年龄19—70岁，平均( 36.47±7.35)岁，其中细胞学和组织学诊断均正常者59例作为正常组，CIN( cervical intraepithelial neoplasia, CIN) CIN1 66例(CIN1组),CIN282例(CIN2组)，CIN3 104例(CIN3组)，SCC(squamous cells cancer，SCC)42例(SCC组)，将353例患者剩余TCT和官颈组织石蜡标本，分别进行HPV E6/E7 mRNA和HPV Ll蛋白检测。

　　一、方法

　　1.HPV E6/E7 mRNA检测：本研究采用分支链DNA技术(bDNA)技术定量检测TCT标本中14种高危型人乳头瘤状病毒( HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)的E6/E7 mRNA。经过标本漂洗，裂解，布板，信号预放大，信号放大，信号检测，后判定结果。

　　2.HPV Ll蛋白检测：收集患者的官颈石蜡包埋组织，通过免疫组织化学法检测HPV Ll蛋白。所用鼠抗人HPV Ll单克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组织化学染色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。HPV Ll蛋白一般位于宿主细胞的细胞核，被染为红棕色，一份标本中只要有一个细胞的核被红染即判定为阳性。用已知阳性片做阳性对照，用缓冲液代替一抗做阴性对照。

　　三、统计学分析

　　采用SPSS 17.0软件进行统计分析。mRNA和Ll蛋白表达与官颈病变严重程度间关系均采用关联分析，两者阳性率比较采用McNemar检验;组间阳性率比较及敏感性、特异性、PPV、NPV比较采用Z检验。多重比较采用Bonferron法。仅=0.05为检验水准。

　　结 果

　　一、不同病变组织学诊断级别中HPV E6/E7mRNA表达情况

　　相关分析表明，E6/E7 mRNA表达和宫颈组织病变级别间存在一定的相关性(f=108.692，

　　P0.005), CIN1组均明显低于CIN2、C-JN3和SCC组(Z分别为24.420、43.689和26.434，均P0.005)。CIN 2/3组mRNA阳性率明显高于CIN1组(Z=103.404，P 0.005

　　表1 不同病变组织学级别中HPV E6fE7 mRNA和Ll蛋白表达情况

　　二、不同病变组织学诊断级别中HPV Ll蛋白表达情况

　　关联分析表明HPV Ll蛋白表达和宫颈组织病变级别间存在一定的关联性( X2=100.418，P 0.005)。

　　三、不同病变组织学诊断级别中HPV E6/E7 mRNA和HPV Ll蛋白表达符合率情况

　　在353例患者中，E6/E7 mRNA阳性率(78.2%)明显高于Ll蛋白阳性率(22.90/0，f=145.313，P 0.005)

　　四、不同诊断方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值

　　以组织学为金标准，E6/E7 mRNA检测方法的敏感性均高于Ll蛋白和联合检测方法(Z分别为9.269和14.291，均P< 0.05)，联合检测方法特异性均高于E6/E7 mRNA和Ll蛋白检测方法(f分别为9.740和24.645，均P<0.05)，联合检测方法的PPV高于Ll蛋白检测方法(X2=9.817，P<0.05)，E6/E7 mRNA检测方法的NPV均高于Ll蛋白和联合检测方法(矛分别为10.257和4.957，均P<0.05)。其他各组间预测值比较，差异均无统计学意义(均P> 0.05)，见表2。

　　讨 论

　　在官颈癌发生过程中，HPV感染是一个必要而非充分的条件口1。这些型别HPV的致癌潜力在于病毒自身的特性以及其能够表达E6/E7蛋白H其机制可能是E6和E7蛋白可以分别抑制抑癌基因p53和pRb，导致上皮细胞永生化[5-6]。本实验结果显示，E6/E7 mRNA表达随组织病变级别的增高而增高，正常组E6/E7 mRNA阳性率均低于CIN2、CIN3和SCC组，CIN2+组mRNA阳性率高于CIN1组。Ll蛋白是HPV病毒表面的主要衣壳蛋白，是宿主免疫细胞和免疫因子识别攻击病毒的主要靶位。本实验中，Ll蛋白表达随着组织病变严重程度的增加而下降，CIN3组和SCC组Ll蛋白阳性率间比较差异无统计学意义，且均明显低于CIN1和CIN2组，由此可知，CIN3病变且Ll蛋白表达阴性时，病变进展的机会相当大，对于此类患者要高度警惕。

　　另外，本研究结果显示，CIN1组Ll蛋白阳性率( 65.2%)明显高于其他各组，这和以往的研究结果一致p1。原因可能是CIN1期时，病毒DNA复制相对活跃，表达产物较多，宿主对病毒的免疫反应较强，疾病可自愈。而对于病变进展的患者，可能是HPV DNA与宿主染色体整合，病毒DNA复制及表达下降，导致Ll衣壳蛋白丢失，进而使宿主失去了攻击HPV病毒的靶位，病变进一步向恶性发展[8-9]。本研究结果还显示，E6/E7 mRNA和Ll蛋白检测符合率较好(73.370/0)。和叶建红等口伽的研究结果相比，在诊断CIN2+时，虽然三种诊断方法的敏感性、特异性、PPV和NPV比较在统计学差异上有些不同，但单从数值大小上看，三种方法的四个值的大小均有相同的趋势，这可能与研究所用样本量较少及选用的检验水准不同有关，故此结果还需要更大样本量及进行研究验证。同时，本研究和以往的研究结果均显示，在降低假阳性率，减少患者进行阴道镜活检及过度治疗方面，联合检测方法具有更好的临床价值。

　　综上所述，HPV E6/E7 mRNA和HPV Ll蛋白的表达与女性官颈病变有密切关系，在诊断高级别宫颈病变时，两种方法联合检测特异性更高。具有非常好的临床应用前景。

　　参考文献

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