复发性流产染色体异常及影响因素分析

　　复发性流产染色体异常及影响因素分析

　　王文华 王晨阳 姜李乐 金彦斌 崔金全

　　【摘要】目的探讨复发性流产染色体异常及影响因素。方法选取2015年1月至2017年11月在郑州大学第二附属医院就诊的复发性流产患者73例，其中52例清官术后新鲜绒毛组织同时行G显带染色体核型分析和高通量测序( NGS)检测;21例因自然流产或药物流产后绒毛组织行NGS检测，其父母均行外周血染色体核型分析。结果①52例清官术后绒毛染色体核型正常37例，数目异常15例;NGS检测正常14例(26.9u/o)，数目异常7例，数目异常且存在拷贝数变异( CNV)7例，仅存在CNV>10 Mb的重复或缺失24例;1例染色体核型分析为45，XO，NGS结果为正常。21例自然流产后绒毛仅行NGS患者中，数目异常5例，CNV>10 Mb的重复或缺失2例，正常14例。73例患者中，父方染色体均正常，母方染色体异常4例( 5.50/0)，其中2例染色体平衡易位者胚胎染色体分别为14-三体合并CNV和7一三体，1例染色体平衡易位和1例10号染色体长臂内倒位者胚胎染色体正常。②73例患者中，年龄≥35岁者绒毛染色体异常发生率(76.7%，23/30)高于年龄<35岁者( 53.50/0，23/43)(P=0.044)。自然流产3次者绒毛染色体异常发生率(73.3%，33/45)高于自然流产≥4次者( 46.40'/0，13/28) (P=0.021);排除胚胎染色体异常因素后，自然流产≥4次者自身免疫抗体阳性率(60.00/0，9/15)高于自然流产3次者(8.3U/o，1/12)(P= 0.006)。结论高通量测序技术可检测染色体微粒缺失，高龄是引起复发性流产胚胎染色体异常的高危因素，自然流产≥4次者自身免疫抗体阳性率增加。

　　【关键词】复发性流产;核型分析;高通量测序;年龄;自身免疫抗体

　　世界卫生组织( WHO)定义复发性流产( RSA)为妊娠20周前发生3次及3次以上的自然流产，发生率为1u/o～3u/om，病因复杂，胚胎染色体异常是重要原因之一，因此对复发性流产患者行流产物染色体检查有助于明确流产病因。目前，绒毛细胞培养结合染色体核型分析技术是临床常用的诊断技术。高通量测序( high-through nextgeneration sequencing，NGS)技术作为二代测序的代表，可发现100 kb以上染色体微缺失、微重复和23对染色体非整倍体改变等染色体异常。有研究发现胚胎染色体异常是高龄妇女孕早期复发性流产的主要原因[2]，另有文献报道免疫因素占复发性流产病因的72.73 0/0[3]。本研究通过对73例流产绒毛组织进行G显带染色体核型分析和NGS检测，探讨检测复发性流产染色体异常及影响因素。

　　资料与方法

　　一、一般资料

　　选取2015年1月至2017年11月就诊于郑州大学第二附属医院的73例复发性流产患者，孕均< 12周，孕妇年龄20～45岁，平均年龄( 32.16±5.28)岁。经患者知情同意，夫妻双方均行外周血染色体核型检查，其中52例清官术后取新鲜绒毛组织行染色体G显带染色体分析同时行NGS检测;21例因自然流产或药物流产后新鲜绒毛组织行NGS检测。根据孕妇年龄分为≥35岁和<35岁组;根据自然流产次数分为自然流产3次组与自然流产≥4次组，两组患者孕次、产次、体质指数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

　　表1 不同年龄和流产次数患者的一般资料(i±s)

　　二、入组标准与排除标准

　　人组标准：①自然流产自行经阴道排出妊娠组织或经临床确诊为稽留流产的患者;②自然流产次数(包括此次妊娠)≥3次。排除标准：①存在生殖道畸形;②生殖道感染;③合并内、外科重大疾病。

　　三、方法

　　1.绒毛细胞的培养及染色体核型分析：清官术后无菌条件下取绒毛组织10～20 mg。采用两步酶解法(胶原酶浓度为0.3 ng/ml;胰蛋白酶浓度为0.25%)处理，于37℃水浴箱放置30 min后离心，取消化后的绒毛组织加入培养基中，在37℃、5%二氧化碳温箱内培养3～5 d后，Giemsa染色，阅片。根据国际人类细胞遗传学命名系统( ISCN2009)描述胚胎染色体核型异常[4]。

　　2.高通量测序：清官术后、自然流产或药物流产后取100 mg绒毛组织，用生理盐水冲洗3次，同时抽取母体静脉血3 ml(EDTA抗凝)，送安诺优达基因科技(北京)有限公司行NGS检查，生物信息法计算所得序列，所有基因序列与人类参考基因组对比，并计数每一个染色体唯一对应序列条数获得全染色体拷贝数变异情况。数据分析通过查阅基因变异数据库( DGV，http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，http://www.omim.org)、人类染色体失衡与表型数据库( DECIPHER，http://decipher.sanger.ac.uk/)、人类基因组数据库(GeneCards，http://www.genecards.org/)及细胞基因组微阵列分析国际标准(ISCA,http://dbsearch.clinicalgenome.org/search/)。

　　3.自身免疫抗体检测：采用ELISA测定孕妇外周血抗心磷脂抗体( ACA)、抗B：糖蛋白1抗体(p 2GPl)和抗Clq抗体;间接免疫荧光法测定抗核抗体( ANA)，免疫印迹法检测可提取抗原( ENA)抗体谱。试剂由德国欧蒙公司提供，按说明书操作及质量控制。抗磷脂抗体阳性诊断标准为ACA-IgG、ACA-IgM及ACA-IgA≥12 RU/ml,p 2GPl-IgG及p 2GPl-IgM≥20 RU/ml为阳性;ANA抗体血清稀释度≥1:100为阳性，抗Clq抗体≥20 RU/ml为阳性，Jol、nRNPSm、Sm、SSA、R052、SSB、Sc170、CENP-B、dsDNA、AnuA、AHA、rRNP抗体检测结果阳性即提示为抗体谱阳性。

　　四、统计学方法

　　采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料通过均数±标准差及f检验表示，计数资料运用X2检验，并以百分比表示，P< 0.05有统计学意义。

　　结 果

　　一、流产组织染色体结果

　　73例患者G显带染色体核型分析及NGS染色体检测均成功，52例流产组织中G显带结果染色体核型正常37例( 71.20/0)，数目异常15例，其中单体4例，三体11例;NGS结果正常14例( 26.90/0)，单体1例，单体合并CNV2例，三体6例，三体合并CNV5例，仅存在CNV >10 Mb的重复或缺失24例;两种检测方法中有1例G显带染色体核型分析结果为45，XO, NGS结果为正常;排除染色体微缺失及微重复，两种检测方法的一致表达率达98.1U/o( 51/52)。21例行NGS的结果为染色体数目异常5例，CNV >10 Mb的重复或缺失2例，染色体正常14例，见表2。

　　表2 2 1例流产绒毛组织高通量测序检测结果

　　染色体结果

　　例数

　　45.XO

　　6一三体

　　16-三体

　　18-三体

　　8p23.3-8p23.2区域500 kb重复

　　4q22.3-4q22.3区域400 kb重复

　　正常

　　二、流产胚胎父母双方外周血染色体检查结果

　　胚胎染色体4例异常，见表3;余69例母方外周血染色体均正常，父方外周血染色体均正常。

　　表3 4例流产胚胎异常母方外周血染色体结果

　　胚胎染色体 母方外周血染色体异常

　　14-三体，lq21.1-lq21.1

　　区域400 kb重复 45, XX, rob(13; 14)(q10; q10)

　　7--体 46XX,t(7;9)(q31; q32)

　　正常 46XX,t(16; 20)(p13.3; q13.1)

　　正常 46XX,inv( 10)(q21.lq23.2)

　　三、影响因素

　　年龄≥35岁者的绒毛染色体异常发生率( 76.70/0，23/30)高于年龄<35岁者(53.50/0，23/43)(P- 0.044);两组染色体数目异常中均以三体为主，分别占75.0%( 9/12)和62.5%( 5/8)。两组自身免疫抗体阳性率比较，差异无统计学意义(P= 0.521)。自然流产3次的患者的绒毛染色体异常发生率(73.3%，33/45)高于自然流产≥4次的患者(46.4%，13/28)(P= 0.021);两组染色体数目异常中均以三体为主，分别占66.7cj/o( 10/15)和80.00/0( 4/5)。排除胚胎染色体异常因素后，自然流产≥4次的患者自身免疫抗体阳性率( 60.00'/0，9/15)高于自然流产3次的患者(8.3%，1/12：P= 0.006)。

　　讨 论

　　一、NGS技术在复发性流产中的应用

　　复发性流产病因复杂，胚胎染色体异常是主要原因之一。G显带染色体核型分析技术目前仍是染色体核型检测的“金标准”。而NGS对所检标本条件要求较低，分辨率及检测成功率高，成为一种快捷、准确、灵活的新型检测手段。本资料中胚胎染色体异常率为63.OU/o( 46/73)，两种检测方法结果有良好的一致性，排除染色体微缺失及微重复，两种检测方法的一致率达98.1u/o，二者均可诊断三体、单体等明显异常核型改变，这些异常大多可导致流产，只有极少数可至足月妊娠，如13-三体、18-三体和21-三体。

　　NGS拷贝数变异(CNV)是备受关注的热点。本研究73例流产组织中CNV 26例，查阅数据库发现有些与生长发育受限、智力障碍、行为异常、器官畸形等相关，其中5号染色体短臂存在26.65 M缺失明确提示该片段缺失与猫叫综合征有关，但许多基因片段的缺失或重复没有明确的临床表型，可导致缺失或重复片段区域内多个基因功能异常，其与RSA的相关性还需更大样本量来研究证明，也只能通过RSA病因的全面筛查权衡基因拷贝数异常的诊断价值。研究显示，复发性流产患者夫妻双方染色体异常率高达31.37%[6]，本研究中共检出母方染色体异常4例。多次出现的流产胚胎CNV的夫妇很有必要行外周血染色体测序检测，证实这些异常是来自于父母还是胚胎染色体的多态性变异。本研究中1例行胚胎移植前遗传学筛查后的流产绒毛组织G显带染色体核型检查为45，XO，NGS结果正常，父母双方外周血染色体结果正常，分析其原因可能是由于胚胎卵裂期部分细胞染色体不分离，在发育过程中45，XO细胞系死亡从而形成嵌合体，而目前的NGS技术难以准确诊断< 20U/o的低比例嵌合体，也进一步说明复发性流产患者胚胎移植前遗传学筛查的局限陛。

　　二、复发性流产的年龄相关因素

　　有研究显示，随着育龄期女性年龄增长，生殖系统的逐渐老化是年龄导致相关妊娠并发症的根本原因[8]，随女性年龄增长，卵母细胞的纺锤丝形成及染色体排列会发生变化，线粒体数量及功能出现异常，导致非整倍体概率增加及表观遗传学的改变[9]。王雪霞等‘司研究发现，胚胎染色体异常是高龄早期复发性流产的主要病因(66.7%)，这与本研究结果( 76.70/0) -致。国外研究显示母亲年龄≥35岁，胚胎染色体发生非整倍体而致流产的风险明显增加[10]，非整倍体胚胎的染色体遗传缺陷大，遗传物质不均衡，可表现出较高的致死率，本研究中≥35岁RSA患者的胚胎染色体数目异常以三体为主，占75.0%，提示了非整倍体胚胎在高龄妇女中的高发风险。

　　三、复发性流产次数与胚胎染色体异常发生的关系

　　国内有研究显示，胎儿核型异常率随自然流产次数增加而下降，这与本研究结果相同，自然流产3次的患者绒毛染色体异常发生率( 75.6u/0)高于≥4次患者(50.6%)[11]。

　　四、复发性流产患者的自身免疫状态异常

　　自身免疫状态异常是导致复发性流产的另一重要原因，抗磷脂抗体综合征( APS)是一组由抗磷脂抗体( APL)介导的一组非炎症性自身免疫性疾病。在复发性流产的自身免疫性病因中，抗磷脂抗体已经成为共识，国外一项系统回顾和荟萃分析显示RSA患者中抗磷脂抗体与磷脂综合征之间存在正相关[12]。APS常见的妊娠并发症为复发性流产，狼疮抗凝物、抗心磷脂抗体和抗p：糖蛋白l抗体是标准的APL，母体患系统性风湿免疫病者流产的发生率增加[13]。本研究排除胚胎染色体异常因素后，自然流产≥4次的患者自身免疫抗体阳性率( 60.00/0)高于3次患者(8.3U/0)，提示随着流产次数增加j自身免疫因素风险增加。目前对于RSA年龄与自身抗体的研究较少，本研究结果提示RSA患者年龄与自身免疫抗体阳性间无明显相关性，这有待于增大样本量进一步研究。因本研究的流产例数少未探讨母体免疫异常与胚胎核型异常之间的关系。

　　综上所述，高通量测序技术可检查出染色体微缺失及微重复，而传统G显带染色体核型分析方法不能，应充分利用每种染色体检查技术优势，积极开展复发性流产患者夫妇双方染色体及流产组织染色体检查，重视高龄对复发性流产胚胎染色体异常发生的影响，全面准确做好复发性流产的病因筛查。

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