Usher综合征一家系的致病基因分析

      Usher综合征一家系的致病基因分析

　　杜伟，徐敏，解正高

　　基金项目：国家自然科学基金青年基金项目( No. 81500759)

　　作者单位：( 225001)中国江苏省扬州市，扬州大学附属苏北人民医院眼科

　　作者简介：杜伟，毕业于北京大学医学部，眼科学博士，主治医师，研究方向：遗传学眼病、眼底病。

　　通讯作者：解正高，毕业于上海交通大学，医学博士，主任医师，副教授，科主任，研究方向：眼底病、眼外伤.zhenggaoxie@ 163. com

　　收稿日期：2018-01-22 修回日期：2018 -08 -24

　　Genetic analysis Usher syndrome of a family with

　　Wei Du, Min Xu, Zheng-Gao Xie

　　Foundation item: National Science Foundation of China ( Youth Foundation No. 81500759 )

　　Department of Ophthalmology, Subei People's Hospital Affiliated to Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

　　Correspondence to:Zheng-Gao Xie. Department of Ophthalmology,Subei People's Hospital Affiliated to Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China. zhenggaoxie@ 163. com

　　Received :2018 -01 -22 Accepted :2018 -08 -24

　　Abstract

　　. AIM: To analyze the clinical features of a Usher syndrome family and explore the pathogenic gene of the disease.

　　. METHODS: A Chinese family with Usher syndrome was involved in our study. After informed consent, careful clinical examinations were taken and 4mL blood were obtained. The whole genome DNA was extracted and target - captured next generation sequencing of the proband was performed to identify suspected mutations. We used Sanger sequencing to verify the detected mutations in all the members of the family, as well as in 100 normal controls.

　　. RESULTS: In addition to typical retinitis pigmentosa, the patients suffered from mild to moderate sensorineurai deafness Sequencing results revealed compound heterozygous mutations (c.2310_2311insA and c.8559-2A>G) of USH2A gene in the patients, and either of the mutations was found in normal relatives that had consanguinity with the patients. Both of the mutations were not found in other members of the family and normal individuals.

　　. CONCLUSION: USH2A is the pathogenic gene of the disease in this family. The mutation c. 8559 - 2A > G (IVS42) is a previously reported mutation, while the mutation c. 2310_2311 insA ( p. E771Rfs * 8) is a novel mutation. The study has expanded the mutation spectrum of USI-f'2A gene resulting in Usher syndrome.

　　.KEYWORDS:Usher syndrome; USH2A gene; frameshift mutation; splice site mutation

　　Citation:Du W, Xu M, Xie ZG. Genetic analysis of a family with Usher syndrome. Gu.oji Yanke Zazhi ( Int Eye Sci ) 2018 ; 18 ( 10 ) :1880-1882

　　摘要

　　目的：对- Usher综合征家系的临床特征进行分析，探索该家系的致病基因。

　　方法：收集于我院就诊的一视网膜色素变性家系，详细询问患者病史并进行临床检查，诊断为Usher综合征，抽取家系成员静脉血4mL，提取全基因组DNA，对先证者进行靶向捕获高通量测序获得突变位点，对于筛选出的可疑突变扩展至家系全体成员进行Sanger测序验证，同时在100名正常对照者中验证。

　　结果：患者除视网膜色素变性表现外，还存在轻至中度感音神经性耳聋，测序结果发现家系患者USH2A基因复合杂合突变c.2310_2311insA(p.E771Rfs$8)和c.8559 -2A>G(IVS42)，而在与患者有直系血缘关系的亲属中发现仅存在其中1个突变，其他家属成员和正常人中未发现该两种突变。

　　结论：USH2A基因为该家系的致病基因,c. 8559-2A>G( IVS42)突变为已报道的热点突变，而c.2310 _2311insA(p.E771Rfs术8)突变则为首次报道，本研究扩展了USH2A基因导致Usher综合征的突变谱。

　　关键词：Usher综合征;USH2A基因;移码突变;剪切位点突变

　　引用：杜伟，徐敏，解正高.Usher综合征一家系的致病基因分析.国际眼科杂志2018;18(10)：1880-1882

　　O引言

　　Usher综合征是一组主要以视网膜色素变性和不同程度听觉障碍为主要特征的疾病综合征，又称为遗传性视网膜色素变性一感音神经性耳聋综合征，发病率约为1/23 000‘¨。根据疾病临床特征，Usher综合征可分为三型‘纠：I型严重，表现为先天性重度听力下降、前庭功能障碍，伴有早发视网膜色素变性;Ⅱ型为常见，听力损失程度相对较轻，表现为中重度感音神经性耳聋，视网膜色素变性发病时间相对较晚;Ⅲ型视网膜色素变性发病时间不定，前庭功能不定，听力障碍程度与Ⅱ型类似，但病情呈渐进性加重。该疾病有较高的遗传异质性，主要遗传方式为常染色体隐性遗传，目前已发现12个与U。he，综合征相关的致病基因‘3‘“1，与Ⅱ型Usher综合征相关的基因有3个，分别为USH2A‘钉、GPR98 [10]和WHRN一基因。其中USH2A基因突变致病为常见。本研究采用靶向捕获高通量测序的方法发现了家系USH2A基因的复合杂合突变c. 2310 _2311insA(p.E771Rfs术8)、c.8559 - 2A>G( IVS42)，其中突变c.2310_2311insA(p.E771Rfs水8)在既往的文献中未见报道，现将结果报告如下。

　　1对象和方法

　　1.1对象 收集2017 -06于我院就诊的一视网膜色素变性家系(图1)，共11例，其中有2例患者，详细询问患者病史并进行临床检查，诊断为Usher综合征。

　　1.2方法本研究遵循赫尔辛基宣言，经苏北人民医院伦理委员会批准，在获得患者和/或家属知情同意后采集每名家系成员静脉血4mL(EDTA抗凝血)进行致病基因突变分析：(1)基因组DNA提取：使用血液基因组DNA提取试剂盒，操作按照试剂盒说明书进行。(2)靶向捕获二代测序：将与Usher综合征相关致病基因(MY07A、USHlC、CDH23、PCDH15、USHlC、CIB2、USH2A、CPR98、WHRAi、CLRN1、CEP250、ARSC共12个基因‘3。“3)的基因组外显子区域定制罗氏NimbleGen捕获探针，进行目标基因全外显子捕获测序：1)首先使用Cavoris仪打断基因组DNA使其片段化至200bp左右，然后经过末端补平修复、3’一端腺苷化、添加接头、扩增、杂交、洗涤磁珠和洗脱DNA、洗脱产物扩增等标准步骤制备文库;2)Illumina hiseq2500平台标准化上机测序，使用Basecall分析软件得到原始数据;3)数据分析：去除接头污染和低质量的数据，将数据与参考序列比对统计，进行单核苷酸多态性( SNP)和插入缺失标记( Indel)检测及注释。根据测序深度，突变质量，对检测得到的SNP、Indel进行过滤筛选，分析氨基酸变化影响、剪切影响、UTR、内含子突变影响等，得到高质量可靠的突变。使用SIFT软件利用基于同源比对、蛋白结构保守性等的算法，预测筛选出变异对蛋白结构和功能的影响，对剪切位点附近的突变，做剪切危害性预测。(3)-代测序(Sanger法)验证：将二代测序得到的高度可疑突变位点扩展至家系全体成员及100名正常对照进行验证，对突变位点周围序列设计引物，采用聚合酶链式反应( PCR)进行扩增，PCR扩增产物用ABI 3730XL测序仪测序，基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

　　2结果

　　家系2例患者为姐弟关系，姐姐Ⅱ一2年龄49岁，临床表现为双侧轻度感音神经性耳聋，无前庭功能障碍，双眼视网膜色素变性、双眼并发性白内障(图2)，其中左眼已行白内障手术，佳矫正视力分别为右眼0. 05、左眼0.3;弟弟Ⅱ-3年龄42岁，临床表现为中度感音神经性耳聋，无前庭功能障碍，双眼视网膜色素变性、双眼并发性白内障(图3)，其中右眼已行白内障手术，佳矫正视力分别为右眼FC/50cm、左眼HM/50cm。

　　对先证者Ⅱ-3进行靶向捕获测序，结果分析提示USH2A基因两个可疑突变c.2310_2311insA(p.E771Rfs水8)和c.8559-2A>G(IVS42)，Sanger测序结果验证显示另一例患者Ⅱ-2同时携带此两个突变(测序峰图见图4)，而与患者有直系血缘关系的亲属I-l、I一2、Ⅱ-6、Ⅲ一1、Ⅲ-2仅携带其中一个突变、均未发病，其他家系成员和100名正常对照中未发现该两种突变。考虑这两个突变为USH2A基因的复合杂合突变。

　　Il卜1111-2 Il1—3

　　图1 Usher综合征家系图 注：口和O分别代表正常男性和女性;■和●分别表示男性和女性患者;回和0分别表示男性和女性携带者;黑色斜箭头所指为先证者。

　　图2家系成员¨-2 A:右眼前节照相可见晶状体明显后囊下混浊;B：左眼眼底清晰可见视盘颜色尚可，视网膜萎缩、mr管明显变细，中周边部视网膜可见骨细胞样色素沉着。

　　图3家系成员11 -3 A:右眼眼底可见视盘颜色变淡，视网膜萎缩严重，中周边部视网膜可见骨细胞样色素沉着;B：左眼眼前节照相可见晶状体明显后囊下混浊。

　　野生型

　　突变型

　　图4家系Sanger测序峰图。

　　3讨论

　　Usher综合征具有高度遗传异质性，常见的遗传方式为常染色体隐性遗传[15]，目前已知的疾病相关基因就有12个，USH2A是其中常见的致病基因，目前已发现位于该基因各个外显子上的上百种突变，包含有错义突变、无义突变、剪切位点突变、插入缺失等各种类型，单USH2A基因就拥有72个外显子，编码5202个氨基酸，因此采用一代测序的方法进行该疾病致病基因的突变筛查无疑将耗费很大的时间和精力。随着二代测序技术的发展，其成本越来越低，使得将靶向捕获高通量测序技术应用到常规的致病基因筛查中成为可能‘16-17。通过二代测序技术可以更快捷有效地发现致病突变，从而进行基因诊断和遗传咨询。

　　我们通过靶向捕获高通量测序技术对一个中国Usher综合征家系进行了致病基因的分析，发现了导致该家系发病的复合杂合突变，一个为剪切位点变异，另一个为移突变。内含子和外显子交接区域的剪切位点突变c.8559-2A>G会导致USH2A基因转录时第43号外显子

　　被跳过，这将导致组成第15个FN3重复结构的41个氨基酸被删除，该突变是一个热点突变，已在既往研究中被报道过18 -。而本研究中另一个既往文献中未报道过的致病突变c.2310_2311insA(p.E771Rfs$8)是一个移码突变，该突变会导致肽链的合成提前终止，产生截短的转录本，通过无义介导的mRNA衰变的细胞保护性机制而降解。

　　本研究证实了靶向捕获高通量测序可以快速有效地进行Usher综合征的致病基因分析、发现致病突变，但该技术的不足之处在于不能覆盖CNV的检测，而CNV的变异已经证实是该疾病的重要发病原因之一‘191。因此在部分患者致病基因筛查时联合CNV的变异分析也是必要的选择。

　　目前对于Usher综合征尚无有效的治疗办法，由于腺病毒介导的基因替代治疗在部分早期视网膜色素变性患者中取得了良好的效果，有不少的研究者将该疾病治疗的研究方向聚焦于基因替代治疗上，但Usher综合征常见的两个致病基因MOY7A和USH2A基因片段均过大而AAV病毒难以承载‘20 3。因此在治疗尚未取得突破性进展的情况下，基因筛查产前诊断和遗传咨询显得更为重要。

　　综上所述，USH2A基因的复合杂合突变为该家系的发病原因，c.8559-2A>G(IVS42)突变为已报道的热点突变，而c.2310_2311insA(p.E771Rfs术8)突变则为首次报道，本研究进一步拓展了Usher综合征的突变谱。

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