细胞凋亡检测实验技术分享

　　这次分享的内容是关于细胞凋亡检测实验技术，详细的内容如下：

　　实验方法原理：

　　本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

　　三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

　　细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区)，显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

　　实验材料：人早幼粒白血病HL-60细胞

　　试剂、试剂盒：

　　三尖杉酯碱、Tris-Hcl、EDTA缓冲液、碱性裂解液、SDS、醋酸钠、异丙醇、乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、琼脂糖、溴乙锭、PI母液、Ho33342母液

　　仪器、耗材：

　　荧光显微镜、电泳仪、电泳槽、微量加样器、离心管、载玻片、盖玻片

　　实验步骤：

　　一、试剂准备

　　1. 三尖杉酯碱(HT)：300μg/ml;

　　2. Tris-HCl(pH7.5)：100mmol/L;

　　3. EDTA缓冲液：5mol/L;

　　4. 碱性裂解液：0.2mol/L NaOH;

　　5. 醋酸钠：3mol/L KAc(pH4.8);

　　6. PI母液：500μg/ml;

　　7. Ho33342母液：2mmol/L;

　　8. 人早幼粒白血病HL-60细胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5% CO2条件下培养。

　　9. 其他：异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。

　　二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡

　　1. 实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6 ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。

　　2. 实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200 μl，使终浓度为1 μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

　　3. Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞

　　(1)染色：将瓶中的细胞摇匀取200 μl于1.5 ml的离心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分钟。

　　(2)滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10 μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。

　　注意事项：

　　1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确;

　　2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

　　其他：

　　细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

　　在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

　　在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。

　　相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

　　一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

　　这次的实验技术的分享就到这里了，欢迎大家来留言讨论。