微生物学实验指导

2018.11.28 15:01
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  这份资料是由华南师范大学生命科学学院的黄文芳、张松编著出的一份资料。这份资料分四部分介绍,第一部分是基础实验,第二部分是实际应用实验,第三部分专题实验,第四部分微生物实验技能的测评。小编就给大家举例资料中的部分实验。

  第一部分 基础实验

  细菌芽孢、荚膜的染色及观察实验

  一、实验目的和内容

  目的:掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。

  内容:1.细菌的芽泡染色。

  2.细菌的荚膜染色。

  二、实验材料和用具

  枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。

  二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)、绘

  图墨水(用滤纸过滤后备用)、95%乙醇、石炭酸复红染液;

  显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l×6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、

  试管夹、擦镜纸、吸水纸。

  三、操作步骤

  (一)芽孢染色法

  1.方法 1

  (1)取 37℃培养 18~24h 的枯草芽孢杆菌作涂片,并干燥,固定(参见“细胞单染色法”)。

  (2)于涂片上滴人 3~5 滴 5%孔雀绿水溶液。

  (3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热,自载玻片上出现蒸汽时,开始计算时间

  约 4~5min。加热过程中切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。

  (4)倾去染液,待玻片冷却后,用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

  (5)用 0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)复染 lmin,水洗。

  (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色,菌体红色。

  2.方法 2

  (1)加 1~2 滴自来水于小试管中,用接种环从斜面上挑取 2~3 环培养 18~24h 的枯草

  芽孢杆菌菌苔于试管中,并充分混匀打散,制成浓稠的菌液。

  (2)加 5%孔雀绿水溶液 2~3 滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

  (3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中,加热 15~20min。

  (4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上,并涂成薄膜,将涂片通过微火 3

  次固定。

  (5)水洗,至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

  (6)加沙黄水溶液,染 2~3min 后,倾去染液,不用水洗,直接用吸水纸吸干。

  (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色,菌体红色。

  (二)荚膜染色法

  1.石炭酸复红染色

  (1)取培养了 72h 的褐球固氮菌制成涂片,自然干燥(不可用火焰烘干)。

  (2)滴入 1~2 滴 95%乙醇固定(不可加热固定)。

  (3)加石炭酸复红染液染色 1~2min,水洗,自然干燥。

  (4) 在载玻片一端加一滴墨汁,另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触,再以匀速推

  向另一端,涂成均匀的一薄层,自然干燥。

  (5)干燥后用油镜观察。菌体红色,荚膜无色,背景黑色。

  2.背景染色

  (1)先加 1 滴墨水于洁净的玻片上,并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。

  (2)放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸收多余的

  菌液。

  (3)干燥后用油镜观察。背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

  四、注意事项

  1.荚膜染色涂片不要用加热固定,以免荚膜皱缩变形。

  2.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄,使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。

  五、实验报告

  (一)绘图

  1.枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态,芽孢的着生位置。

  2.褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。

  (二)试制片,但不进行染色,观察是否能看到芽孢和荚膜?

  七、问题和思考

  1.为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?

  2.组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法,为什么?

  3.试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

  第二部分 专题实验

  微生物的诱变育种

  一、实验目的和内容

  目的:以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例,学习微生物诱变育种

  的基本操作方法。

  内容:1.对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理,制备孢子悬液。

  2.用紫外线进行诱变处理。

  3.用平板透明圈法进行两次初筛。

  4.用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。

  二、实验材料和用具

  米曲霉斜面菌种;

  豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白;

  三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、

  磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。

  三、操作步骤

  (一)出发菌株的选择及菌悬液制备

  1.出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株,或选用高产蛋白酶的米曲

  霉菌株。

  2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中,30℃培养 3~5d 活化。然后孢

  子洗至装有 1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠,装量以大致铺

  满瓶底为宜),30℃振荡 30min,用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤,制成把子悬液,调其浓度

  为 106

  ~108个/mL,冷冻保藏备用。

  (二)诱变处理

  用物理方法或化学方法,所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定,有时还可

  采用复合处理,可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。

  1.紫外线处理 打开紫外灯(30W)预热 20min。取 5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)

  中,同时制作 5 份。逐一操作,将培养皿平放在离紫外灯 30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器

  上,照射 l min 后打开培养皿盖,开始照射,与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅

  拌,即时计算时间,照射时间分别为 15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后,诱变菌液

  在黑暗冷冻中保存 1~2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。

  2.稀释菌悬液 按 10 倍稀释至 10-6,从 10-5 和 10-6 中各取出 0.lmL 加入到酪素培养

  基平板中(每个稀释度均做 3 个重复),然后涂菌并静置,待菌液渗入培养基后倒置,于 30

  ℃恒温培养 2~3d。

  (三)优良菌株的筛选

  1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小,并测量其菌落直径与透明圈直径之

  比,选择其比值大且菌落直径也大的菌落 40~50 个,作为复筛菌株。

  2.平板复筛 分别倒酪素培养基平板,在每个平皿的背面用红笔划线分区,从圆心

  划线至周边分成 8 等份,1~7 份中点种初筛菌株,第 8 份点种原始菌株,作为对照。培养

  48h 后即可见生长,若出现明显的透明圈,即可按初筛方法检测,获得数株二次优良菌株,

  进大摇瓶复筛阶段。

  3.摇瓶复筛 将初筛出的菌株,接入米曲霉复筛培养基中进行培养,其方法是,称取

  麦秩 85g,豆饼粉(或面粉)15g,加水 95~110mL(称为润水),水含量以手捏后指缝有水而不

  下滴为宜,于 500mL 三角瓶中装入 15~20g(料厚为 1~1.5cm),121℃湿热灭菌 30min,然

  后分别接入以上初筛获得的优良菌株,30℃培养,24h 后摇瓶一次并均匀铺开,再培养 24~

  48h,共培养 3~5d 后检测蛋白酶活性。

  4.蛋白酶的测定方法

  (1)取样:培养后随机称取以上摇瓶培养物 1g,加蒸馏水 100mL,(或 200mL),40℃水浴,

  浸酶 1h,取上清浸液测定酶活性。另取 lg 培养物于 105℃烘干测定含水量。

  (2)酶活性测定:30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为 0.5%酪蛋白),每分钟产酪氨酸

  1μg 为一个酶活力单位。计算公式为:

  (A 样品 OD680nm 值-A 对照 OD680nm 值)×K×V/t×N

  K:标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数;

  V:酶促反应的总体积;

  t: 酶促反应时间(min);

  N:酶的稀释倍数。

  5.谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。

  检测培养基:豆饼粉:麸夫=6:4,润水 75%,121℃湿热灭菌 30min。

  谷氨酸测定:于以上培养基中加入 7%盐水(W/V),40~45℃水浴,水解 9d 后过滤,以

  滤液检测谷氨酸含量(测压法)。

  四、注意事项

  1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。

  2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行,并在黑暗中培养。

  五、实验报告

  1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。

  2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点,如何改进?

  六、问题和思考

  1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。

  2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间?

  注:筛选菌株数的计算 若按突变率为 0.01 计算,则一次筛选可取 250—300 个菌落,

  第一次筛选后可多选几株高产株,而二级筛选为重点阶段,其最适量可参考以下计算方法:

  如初筛菌株数为 200 株,二次筛选欲选株数为 2 株,则二级应选(200×2)1/2,为 20 株,这样

  的数量选择,使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。

  实验时在医学科研中必不可少的一部分,而参阅文献资料也是不可少的,小编给大家整理的这份微生物学实验指导,读者可以参阅起来。小编已将文档上传至网页中,大家可通过以下方式获取:

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