凝胶迁移实验(EMSA)原理及步骤

2018.11.14 11:05
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        一、凝胶迁移实验(EMSA)原理

  凝胶迁移实验是一种研究 DNA 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术,这项技术是基于 DNA 蛋白质或 RNA 蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。近年来,EMSA 已发展成为体外研究核酸,尤其是 DNA 与蛋白质相互作用的一种简单,迅速,而灵敏的方法,已成为了转录因子与核酸体外相互作用的经典方法。

凝胶迁移实验(EMSA)原理

  二、凝胶迁移实验(EMSA)所需材料

  1、实验材料:

  DNA样品

  2、试剂、试剂盒:

  [γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED(四甲基乙二胺)、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝。

  3、仪器、耗材:

  水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽

  三、凝胶迁移实验(EMSA)步骤

  (一)探针的标记:

  1. 如下设置探针标记的反应体系:

  (1)待标记探针 (1.75 pmol/微升) :2微升。

  (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1微升。

  (3)Nuclease-Free Water :5微升。

  (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1微升。

  (5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1微升。

  (6)总体积 10微升

  (7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。

  2. 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。

  3. 加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。

  4. 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。

  5. 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

  (二) 探针的纯化

  通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作:

  1. 对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。

  2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。

  3. 在4℃,12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。

  4. 在4℃,12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。

  5. 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

  (三)EMSA 胶的配制

  1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

  2. 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

  (1)TBE buffer (10X): 1毫升。

  重蒸水 16.2毫升。

  (2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2毫升。

  (3)80% 甘油: 625微升。

  (4)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) :150微升。

  (5)TEMED :10微升

  3. 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

  (四)EMSA结合反应

  1. 如下设置EMSA结合反应

  阴性对照反应:

  (1)Nuclease-Free Water :7微升。

  (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。

  (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 0微升。

  (4)标记好的探针 :1微升。

  (5)总体积 :10微升。

  样品反应:

  (1)Nuclease-Free Water :5微升。

  (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。

  (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。

  (4)标记好的探针: 1微升。

  (5)总体积: 10微升。

  探针冷竞争反应:

  (1)Nuclease-Free Water :4微升。

  (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。

  (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2微升。

  (4)未标记的探针: 1微升。

  (5)标记好的探针: 1微升。

  (6)总体积 :10微升。

  突变探针的冷竞争反应:

  (1)Nuclease-Free Water :4微升。

  (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。

  (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。

  (4)未标记的突变探针: 1微升。

  (5)标记好的探针: 1微升。

  (6)体积 :10微升

  Super-shift反应:

  (1)Nuclease-Free Water:4微升。

  (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。

  (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。

  (4)目的蛋白特异抗体 :1微升。

  (5)标记好的探针:1微升。

  (6)总体积 :10微升。

  2. 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。

  3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。

  (五) 电泳分析

  1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。

  2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。

  3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。

  4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

  5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。

  四、凝胶迁移实验(EMSA)注意事项

  1.通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。

  2.DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。

  3.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。

  4.当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。

  5.在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。

  6.竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。


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